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Introducción
El color de la cáscara en los frutos es un atributo decalidad que influencia las preferencias del consumidor, einduce la expectativa de sabor, gusto y palatabilidad (Wadheray Capaldi-Phillips, 2014), siendo al mismo tiempo en lamayor parte de los vegetales una variable utilizada comoindicador de estado de madurez y/o deterioro de calidad delos mismos (Castro Camacho, Cerquera Peña y GutierrezGuzmán, 2013; Wadhera y Capaldi-Phillips, 2014). Es porello que también es de utilidad para su aplicación en cultivoy/o industria construir escalas de colores utilizando instrumentoscomo colorímetros, procesamiento digital de imágenesy otras técnicas de determinación objetivas de color,para reducir la subjetividad de los operadores (CIE, 2004;Castro Camacho, Cerquera Peña y Gutierrez Guzmán,2013). Por otro lado, el color en la cáscara de los frutos esconsecuencia de la concentración y distribución de pigmentospresentes en los tejidos. Los pigmentos se encuentranprincipalmente en los cloroplastos y cromoplastos (clorofilasy carotenoides), y en las vacuolas los compuestosfenólicos (antocianos, flavonoides, cumarinas, quinonas yotros). Las clorofilas responsables del color verde, y dominantesen los vegetales, son la clorofila a que confiere altejido el color azul-verde (verde intenso) y la clorofila b queotorga el color amarillo-verde (verde), ambos presentes enuna relación de 2 o 3 a 1 (Lancaster et al., 1997). Loscarotenoides son más de 600 compuestos producidos porlos vegetales, algunos de los cuales son responsables delos colores en gamas del amarillo, anaranjado y rojo; pocosson fuente de provitamina A, y por su estructura químicatienen alto potencial como antioxidantes (Hock-Eng Khoo etal., 2011; Gülçin, 2012). Los compuestos fenólicos comolas antocianinas desarrollan colores rojo, rosa, azul o púrpura,dependiendo del fruto, mientras que cumarinas y algunosflavonoides tienen colores en tonos de blanco amarillento,teniendo también estos compuestos alta capacidadantioxidante (Kader y Barrett, 1996; Gülçin, 2012). Los cambiosde color en la cáscara de la mayor parte de los frutosson debidos a la degradación de las clorofilas provocadapor cambios en el pH, contenido de ácidos, y aumento deprocesos oxidativos y de la actividad de las clorofilasas(Kader y Barrett, 1996; Crowhurst et al., 2008; González,2010). Sin embargo la expresión del color no solo dependede los pigmentos presentes sino además de otros aspectosfísicos y/o químicos del vegetal (Timberlake y Henry, 1986;Lancaster et al, 1997). La presencia de ceras, tricomas yotras estructuras epiteliales, el tamaño de las células y topografíadel tejido influyen en la reflexión y refracción de la luzincidente (Lancaster et al., 1997). Al mismo tiempo, las clorofilasy sus derivados, los carotenoides y compuestosfenólicos forman parte de los compuestos fitoquímicos. Algunasde estas moléculas están involucradas en los procesosde la fotosíntesis (clorofila y carotenoides), y se lesatribuye acciones biológicas relacionadas a actividad antioxidante,respuesta inmune, de comunicación celular invivo y antimutagénica, que contribuyen a reducir los riesgosdel desarrollo de algunas enfermedades y prevenciónde diferentes tipos de cáncer (Steinmetz y Potter, 1996;Basile et al., 1997; Ferruzzi y Blakeslee, 2007; Ebrahimzadehet al., 2008; Weston, 2010).
Los frutos de guayabos del país [Acca sellowiana (Berg)Burret] que forman parte de proyectos de prospección, seleccióny mejoramiento genético, presentan distintos coloresde cáscara en el rango de amarillo y verde, siendo esteuno de los atributos que hacen a la caracterización de clonesy/o variedades (Vignale y Bisio, 2005; González, 2010;Calvete, 2013; Puppo et al., 2014; Vignale et al., 2015). Enlos trabajos de selección y mejoramiento genético en Uruguayse han construido escalas visuales del color de lacáscara, junto a otros atributos de los frutos (Puppo et al.,2014). El color verde de la cáscara de guayabos de laespecie [Acca sellowiana (Berg) Burret] se mantiene en lamayoría de los frutos de plantas silvestres o cultivadas aúnen su estado de madurez organoléptica (Calvete, 2013;Puppo et al., 2014; Quezada et al., 2014; Pasquariello et al.,2015).
Los frutos de guayabo se consumen en fresco principalmentesin cáscara, pero hay algunas selecciones de cáscaramuy fina que pueden consumirse enteros (Vignale yBisio, 2005; Calvete, 2013; Silveira et al., 2015), por lo cualla cuantificación de los compuestos fitoquímicos asociadosal color de la cáscara puede contribuir a valorizar aún máslas virtudes nutracéuticas de estos frutos (Weston, 2010).Así mismo, la caracterización física y química de la cáscaraes relevante para identificar su uso potencial como materiaprima en la industria de alimentos innovadores o farmacéutica,debiéndose tener en cuenta que los procesosdomésticos y/o industriales alteraran estos compuesto(Ebrahimzadeh et al., 2008; Weston, 2010; Sun-Waterhouseet al., 2013; Duong y Balaban, 2014; Quintero, 2015). Enconsecuencia, el objetivo de este trabajo fue caracterizarcon parámetros colorimétricos del espacio CIELAB cadacategoría de color de la escala visual para la cáscara utilizadaen los trabajos de selección y mejoramiento genético defrutos de guayabos del país, y reportar la cantidad de clorofilay carotenoides totales.
Materiales y métodos
Material vegetal
Los frutos de guayabos fueron obtenidos durante unmuestreo de rutina de evaluaciones de materiales genéticosdel Jardín de introducción y mejoramiento genético deguayabos instalados en la Estación Experimental de SanAntonio de la Facultad de Agronomía (latitud S 31.33, longitudW 57.83). Fueron cosechados más de ochenta frutosen estado maduro, utilizando el criterio de cosecha cuandoestos son removidos manualmente de la planta con facilidad(touck-picking) (Silveira et al., 2015). Las frutas cosechadasse asignaron a cinco clases de una escala visualde color de cáscara (amarillo a verde) denominadas: Amarilla(A), Amarilla Verde (AV), Verde Amarilla (VA), Verde (V)y Verde Verde (VV), (Figura 1). Una muestra aleatoria de 10frutos por cada clase de la escala visual fue utiliza en lasdeterminaciones posteriores. Los frutos se mantuvieron encondiciones ambientales del laboratorio (20 ºC y 80 % HR)por 24 h antes de ser analizados.
Color
Las variables del color de la cáscara se midieron en lazona ecuatorial del fruto (n = 10) sobre cuatro puntos opuestosy sin presencia visual de defectos. Se utilizó un colorímetroCR10 (Konica Minolta, Japón) determinando el color en elespacio triestímulo CIELAB (L*a*b*) con iluminante D65,observador estándar 10º y apertura 8 mm, midiendo losvalores L* a* y b*. Se calculó la relación a*/b*, y el tono(ºhab), la saturación (C*ab) y la diferencia del color (ΔEab)con las siguientes ecuaciones (CIE, 2004):
ºhab = artg (b*/a*)
C*ab = [(a*)2+(b*)2]0.5
ΔEab= [(ΔL*)2+(Δa*)2 (Δb*)2]0.5
Además se calculó un índice de color (IC) con la ecuaciónutilizada en la escala de color de cáscara de cítricos(Jiménez-Cuesta, Cuquerella y Martinez-Javega, 1982)
IC = 1000 [a* (L* b*)-1]
Se guardaron en congelador (-20 ºC) cinco frutos enterossin daños visibles de cada color de cáscara para medirposteriormente el contenido de pigmentos de la cáscara.
Contenido de clorofila y carotenoides totales
El contenido de clorofila y carotenoides totales se determinóen la cáscara de los frutos. Se consideró sólo el exocarpiocortando con un bisturí un espesor aproximado de0,2 a 0,5 mm. En el caso que correspondió se removieronlos restos de mesocarpio (Castro Camacho, Cerquera Peñay Gutierrez Guzmán, 2013) diferenciándose claramentedebido al rápido oscurecimiento de ese tejido (pardeamientoo browning).
La determinación de clorofila a, clorofila b y carotenoidestotales se realizó de acuerdo a Arno (1949) y las modificacionesy cálculos sugeridos por Lichtenthaler y Wellburn(1983). La extracción, para cada color de cáscara, fue obtenida de una muestra compuesta de la cáscara de cincofrutos. Se realizaron 10 extracciones totales de cada colorde cáscara en el área entrono a la zona ecuatorial de losfrutos (± 1 cm), y tres repeticiones analíticas por extracción.Se utilizó para cada extracción 0,050 g de cáscara y10 mL de acetona (80 %) homogenizado la muestra a 3500rpm por 45 s (UltraTurrax XHF-D IKA, China). El extractose filtró rápidamente con papel de filtro. Todos los procedimientosse hicieron manteniendo la muestra en hielo y oscuridada fin de minimizar la degradación de compuestos.El extracto filtrado obtenido se midió inmediatamente en unespectrofotómetro (Unico S2150UV, UV-Visible) en tres longitudesde onda: λ 663 nm, λ 646 nm y λ 470 nm. Secalculó el contenido de clorofila a (Cl a), clorofila b (Cl b),clorofila total (Cl t) y carotenoides totales (C x+c) con lassiguientes ecuaciones:
Cl a = 2,21A663 - 2,81A646
Cl b = 20,13A646 - 5,03A663
Cl t = Cl a + Cl b
C x+c = (1000 A470 -3,27 Ca-104 Cb) (229)-1
Los resultados se expresaron en miligramos de clorofilao carotenoides totales por gramo de peso fresco de cáscarade guayabo (mg g-1 PF).
Análisis estadístico
Los datos obtenidos en las variables de color luminosidad(L*), tono (ºhab), saturación (Cab*), relación a*/b*, índicede color (IC), diferencia de color (Δ Eab) y contenido declorofilas y carotenoides totales se analizaron estadísticamenterealizando un análisis de varianza (p = 0,95) y cuandocorrespondió se compararon las medias utilizando eltest de Tukey (p ≤ 0,05). Se realizó además un análisis derelación entre la escala visual del color de la cáscara y losparámetros de color y contenido de clorofila y carotenoidesdeterminadas, calculando el coeficiente de correlación linealde Pearson (p ≤ 0,05), asignando a la escala visualvalores crecientes de color verde con una escala ordinal de1 (A) a 5 (VV).
Resultados y discusión
Color
La luminosidad (L*) del color de los frutos de las categoríasde la escala visual fueron entre si distintas estadísticamente(p ≤ 0,0001) siendo la cáscara de los frutos menosluminosa al aumentar el color verde de la escala visual(Cuadro 1). La saturación del color (C*ab) también disminuyóal aumentar el color verde, observándose el color másvivo e intenso de la cáscara A y AV. Al mismo tiempo el tono(ºhab) de color se correspondió a los colores amarillo yverde representados en la escala, siendo similares estadísticamenteel tono de la cáscara AV y VA. Este resultadofue similar a los obtenidos en la relación a*/b* [variables a*(-a* verde, +a* rojo) y b* (-b* azul, +b* amarillo)].
Cuadro 1 Luminosidad (L*), tono (ºhab) y saturación (C* ab), relación a*/b* e índice de color (IC) en cinco coloresde cáscara de guayabos.
Los valores de la variable b* disminuyeron entre cadacategoría de color en mayor proporción para el color decáscara V y VV, al mismo tiempo que los valores de lavariable a* se mantuvieron constantes, diferenciándose estadísticamentesólo del color A (Figura 2). Esto implicó, en laescala visual de colores de cáscara que va desde el colorA a VV, una reducción de valores amarillo (+b*) y en menorproporción de los valores verde (-a*). Esto coincide con loobservado en las categorías establecidas en la escala visual(Figura 1 y 2) y probablemente sea explicado por elaumento de las clorofilas, en especial la clorofila a desde elcolor de cáscara A a VV (Figura 3). Pasquariello et al. (2015)reportaron los parámetros luminosidad (L* 37,5 a 43,3) ytono (112,8 a 102,1 ºh) de la cáscara de frutos de docevariedades cultivadas de guayabos (Acca sellowiana) correspondiéndosea similares valores obtenidos en nuestrotrabajo para las categorías de color VA y V de la escalavisual. Sin embargo no es posible en este caso atribuirles adichas variedades un color de las categorías de nuestraescala visual dado que dichos autores no reportan la saturacióny/o los parámetros a* y b* del color. Por el contrario,los guayabos de la variedad Unique utilizados en el trabajode Duong y Balaban (2014) se corresponden con el colorde cáscara verde amarillo de nuestra escala visual.
Figura 2 Variables a* y b* en cinco colores de cáscara de guayabos. Letras distintas entre columnas de la misma variable(a* o b*) indican que son diferentes estadísticamente (Tukey ≤ 0,05).
Figura 3 Contenido de clorofila a, clorofila b, clorofila total y carotenoides totales en cinco colores de cáscara de guayabos.Media ± EE (n = 30). Letras distintas sobre las columnas dentro de cada variable indican que son estadísticamente diferentes(Tukey ≤ 0,05).
El índice de color (IC) desarrollado para cítricos por Jiménez-Cuesta, Cuquerella, y Martinez-Javega(1982), ytambién aplicado en variedades de pomelo por Conesa,Manera y Cámara (2006), fue reportado por estos autorescon alto coeficiente de correlación lineal (95 %) entre lasapreciaciones visuales del color y las determinacionesinstrumentales en el rango de colores de verde oscuro(valores negativos) y amarillo (valores positivos). Enguayabos del país, los valores del IC obtenidos paracada color de la escala visual se diferenciaron estadísticamenteentre sí (p ≤ 0,0001). Los valores del IC entre lascategorías correlativas de la escala visual presentaron distanciassimilares, a excepción de los colores de la cáscaraAV (-4) y VA (- 5) (Cuadro 1), sin embargo todos los coloresse diferencian claramente entre sí (ΔEab). En el Cuadro 2se presenta la diferencia entre los cinco colores (ΔEab) dela cáscara de la escala visual. Los resultados obtenidosconfirman diferencias importantes (9 a 35,5) entre los coloresde la escala visual que son distinguidos muy fácilmentepor un observador no experto. En el Cuadro 3 se presentala correlación lineal de Pearson (r) entre la escala visualdesde el color A a VV y los parámetros del espacio CIELAB,la relación a*/b* y el IC calculado. Los coeficiente decorrelación entre la escala visual y dichas variables fueronaltos y negativos (> -0,900), exceptuando el tono (0,925)con valores positivos y un valor más bajo de r para elparámetro a* (-0,580). Los coeficientes de correlación linealobtenidos entre el IC y los parámetros de color fueronsimilares y de signo contrario a los obtenidos con la escalavisual. Esto era esperable dado que el IC está determinadopor cálculo con los valores L*, a* y b*. Al mismo tiempo elsentido de la correlación es opuesto al de la escala visual(1 A a 5 VV) dado que el IC tiene valores decrecientes de 0(A) a -17 (VV).
Cuadro 2 Diferencia de color (ΔE*ab) entre los colores de la escala visual para la cáscara de guayabos.
Las variables L*, a*, b*, ºhue, C* y a*/b* si bien tuvieronalto coeficiente de correlación con la escala visual, por sísolas en forma independiente no definen ningún color. Paradefinir el color debe indicarse tres variables L*, ºhue y C* oL* a* b*. En cambio, el IC es calculado en base a las tresvariables que definen el color en el espacio CIELAB (L*, a*,b*) observándose un coeficiente de correlación alto (-0,894)con la escala visual (Cuadro 3). Por tanto, los valores obtenidosdel IC (0, -4, -5, -12, -17) podrían ser utilizados comodefinición práctica de cada categoría de la escala visual delcolor de cáscara analizada.
Clorofila y carotenoides totales
El contenido de clorofila total en la cáscara de guayabosdel país fue desde 0,160 a 0,533 mg g-1 PF. La cáscara decolor VV (0,533 mg g-1 PF) presentó similar contenido declorofila total que la cáscara de color V (0,387 mg g-1 PF),siendo diferente de los demás colores de la escala visual(Figura 3). En la cáscara de color A, AV y VA se cuantificóun 70 a 57 % menos de clorofila total que en los otros doscolores. La cantidad de clorofila a fue tres y cuatro vecessuperior en la cáscara de color V y VV que los que tienenmás colores amarillos. Al mismo tiempo las diferenciasencontradas en el contenido de clorofila b fueron dos a tresveces superiores en la cáscara de esos colores. La relaciónentre la Cl a: Cl b fue 1,7 y 2,1 para el color de cáscaraA y AV, y tres para los demás colores. Estos resultados demayor contenido de clorofila en los colores de la cáscaramás verde son concordantes con lo observado en la escalavisual desde el color verde amarillo vivo al color verdemás opaco y oscuro. El contenido de carotenoides totalesfue de 0,043 a 0,119 mg g-1 PF y aumentó con el color verdede la cáscara (Figura 3). Los carotenoides están ubicadosen los cloroplastos, enmascarados por la clorofila e interviniendoprobablemente como antioxidantes y protectores delas células en los procesos del deterioro del fruto (Timberlakey Henry, 1986; Hock-Eng Khoo et al., 2011). Los coeficientesde correlación lineal (r) obtenidos entre la escalavisual de color de cáscara y la clorofila total y la clorofila bfueron medios (0,557 y 0,346), presentando una correlaciónalta (0,802) la clorofila a (Cuadro 3). La clorofila a pigmentalos tejidos vegetales de azul-verde (Lancaster et al.,1997) confiriendo un color más verde a la cáscara de guayabo,como se observó en la escala visual para el V y VV.Por el contrario, los carotenoides totales no tuvieron correlaciónestadísticamente significativa con el color de la escala(Cuadro 3). En el Cuadro 3 se presenta un coeficiente decorrelación (r) medio entre el IC calculado con el contenidode clorofila total (-0,603) y con clorofila a (-0,688), indicandoque a mayor valor de IC calculado (0 = A,-17 = VV) menorfue el contenido de clorofila. El coeficiente de correlaciónmedio obtenido entre estas variables puede estar sugiriendo,en concordancia con Timberlake y Henry (1986) yLancaster et al. (1997), que además de la clorofila otrosfactores que participan en la construcción física y químicade la cáscara están contribuyendo a definir el color de losfrutos. Si bien, entre otros autores Ebrahimzadeh et al.(2008), Weston (2010), Sun-Waterhouse et al. (2013), Duongy Balaban (2014), Silveria et al. (2015) han reportado elcolor, así como la composición de nutrientes y otros fitoquímicosen frutos de guayabo (Acca sellowiana), no se encontraronreferencias en contenido de clorofila y carotenoidesde la cáscara en esta especie. En la cáscara de otrosfrutos, Lancaster et al. (1997) reportaron el contenido declorofila de manzana verde (Malus pumilla, L.) 0,064, pepino(Cucumis sativum L.) 0,792, lima (Citrullus limon L.) 0,276,y morrón verde (Capsicum annum L.) 0,170 mg g-1 PF. Estosautores también cuantificaron en la cáscara de estos vegetalesel contenido de carotenoides totales correspondiéndosecorrelativamente a 0,008, 0,061, 0,019 y 0,025 mg g-1 PF.La relación entre carotenoides totales y clorofila total de lacáscara de estas frutas fue menor (6,9 % a 14,7 %) a laobtenida en los frutos de guayabos (22,3 % a 39,1 %). Sinembargo, con rango de contenido de carotenoides totalesmás alto en la cáscara de guayabos (0,043 a 0,119 mg g-1 PF)que en las especies estudiadas por Lancaster et al. (1997),se observó igual tendencia, en la cual valores altos decarotenoides totales se asociaron también a valores altosde clorofila. En similar sentido González (2010), en tresvariedades de guayaba de cáscara de color amarillo verde(Psidium guajava) y en el momento de cosecha, cuantificó0,004 a 0,014 mg de clorofila total g-1 PF y 0,044 a 0,047mg g-1 PF de carotenoides totales en muestras homogeneizadade cáscara, pulpa y semilla.
En conclusión, los resultados obtenidos en las variablesde color medidas en el espacio tridimensional CIELAB permitieronasignar valores objetivos a los colores de la escalavisual utilizada en la selección y mejoramiento genético deguayabos del país. Esto posibilitará comparar el atributo decolor de cáscara entre diferentes grupos de investigadoresy operadores del sector productivo y/o de mercado. El indicadorde color utilizado en frutos cítricos puede ser empleadopara tipificar las cinco categorías de colores establecidosen la escala visual de la cáscara de guayabos del país.Además se ha cuantificado por un método sencillo el contenidode clorofila y carotenoides totales, que son pigmentosresponsables del color de la cáscara. Al mismo tiempo,esta información contribuye a valorar aún más la cáscarade guayabos del país por su potencial aporte de estos fitoquímicosen la alimentación humana.
