Introducción
La harina de soja es uno de los concentrados proteicos más ampliamente utilizados en la alimentación de las vacas lecheras de alta producción debido a su elevada concentración de proteínas de alta calidad. Según distintos autores, representa una buena fuente de proteína indegradable en el rumen, por lo que, debido a su elevado valor biológico (perfil de AA), resulta beneficioso que su proteína sea protegida de la acción microbiana y llegue intacta al intestino, como proteína de pasaje, más aún en animales de alta producción (Stern y col., 1985; Santos y col, 1998).
En general, mediante los tratamientos térmicos, se produce la desnaturalización de la proteína y formación de enlaces proteína-carbohidrato y enlaces cruzados proteína-proteína (NRC, 2001), protegiéndola de la acción de los microorganismos ruminales y aumentando la disponibilidad de AA en el duodeno (desde 40 a 70%) y favoreciendo su digestión (Stern y col., 1985), lo que puede repercutir en una mayor producción de leche (Ipharraguerre y col., 2005).
Los expeller de soja, obtenidos a partir de la extracción de aceite mediante prensión, reciben un tratamiento térmico más intenso que las harinas de soja, aumentando la resistencia a la proteólisis y, por tanto, disminuyendo su degradabilidad ruminal. Sin embargo, su repercusión en la producción de leche no está clara en la literatura existente. Si bien, en varios trabajos se reporta un incremento en la producción de leche (kg/día) cuando se sustituyen harinas de soja por expeller (Broderick y col., 1990; Titgemeyer y Shirley, 1997; Reynal y Broderick, 2003; Giallongo y col., 2015), en otros trabajos, no se evidenció este efecto (McCormick y col., 2001; Loor y col., 2002; Broderick y col., 2013). La variabilidad en los resultados existentes podría deberse, en parte, a las diferentes condiciones de procesamiento industrial presentes durante la extracción del aceite. Es sabido que los beneficios de los procesos térmicos pueden perderse cuando se aplica excesiva temperatura debido a las reacciones de Maillard (Van Soest, 1994), lo cual afectaría la degradabilidad ruminal y la digestibilidad intestinal de los suplementos proteicos (Stern y col., 1994). Existe muy poca información acerca de la calidad nutricional de los subproductos de soja obtenidos en Uruguay y los que ingresan al país. Algunos resultados de análisis químicos de harinas de soja fueron reportados anteriormente por otro autor (Mieres, 2004), pero con respecto a la degradabilidad ruminal son nulos los antecedentes nacionales por lo que, en general, se debe recurrir a valores de tablas internacionales cuando se formulan dietas para animales en producción.
El objetivo del presente trabajo fue determinar el valor proteico de diferentes subproductos de soja para vacas lecheras, con especial énfasis en la correcta valoración de la proteína de pasaje.
Materiales y métodos
Se evaluaron 8 subproductos de soja a través de las técnicas de degradabilidad ruminal in situ, producción de gas in vitro y degradabilidad ruminal in vitro de la proteína. Las muestras evaluadas fueron obtenidas en muestreos realizados en distribuidores de alimentos para vacunos de diferentes puntos de la cuenca lechera uruguaya (San José, Colonia, y Río Negro). Los subproductos fueron categorizados como harinas o expeller de acuerdo a su contenido en extracto etéreo (EE) (harina < 3,0 % de EE, expeller ≥ 5,5% de EE; (UNIT, 2008), conformando un total de 4 muestras por categoría (Tabla 1). Los análisis de composición química fueron realizados en las instalaciones del laboratorio de nutrición de la Cooperativa Colaveco (Nueva Helvecia, Colonia, Uruguay). Los ensayos de degradabilidad ruminal in situ y de producción de gas in vitro fueron realizados en las instalaciones del Instituto de Producción Animal de la Facultad de Veterinaria (Ruta 1 km 42,500 - San José, Uruguay), mientras que el ensayo de degradabilidad ruminal in vitro de la proteína fue realizado en el Laboratorio de Bromatología y Nutrición de Rumiantes de la Universidad Federal de Santa María (Camobi, Santa María, Brasil).
Degradabilidad ruminal in situ
Fue conducido un ensayo de degradabilidad ruminal in situ (Mehrez y Orskov, 1977). Se utilizaron 3 vacas no lactantes (peso vivo promedio: 516 ± 25 kg), provistas de cánulas ruminales (10 cm de diámetro interno, ANKOM Technology Corp., Fairport, NY, USA) y alimentadas con una dieta formulada para cubrir los requerimientos de mantenimiento. Se les ofreció ad libitum heno de Moha (Setaria itálica) cuya composición química fue en g/kg de materia seca (MS): 46 g de proteína bruta (PB) y 632 g de fibra neutro detergente (FND), suplementado con 2 kg de concentrado (267 g de PB y 173 g de FND) ofrecido a las 8:00 h de cada día, compuesto por (g/kg) 475 g de grano húmedo de maíz, 475 g de harina de soja y 50 g de premix vitamínico-mineral. Las vacas tuvieron libre acceso durante todo el periodo experimental a agua de bebida y contaron con un periodo de adaptación de 20 días.
Las muestras de los distintos subproductos de soja fueron secadas en estufa a 55°C durante 72 h y molidas a 2 mm (Fritsch GmbH, Idar-Oberstein, Birkenfeld, Germany). De cada muestra (n=8), se pesaron 10 g en bolsas de poliéster (10,5 × 21 cm; 52 µm de tamaño de poro, ANKOM Technlogy Corp., Fairport, NY, USA). Las bolsas fueron colocadas en la porción ventral del rumen, sujetas a una cadena metálica con una pesa en el extremo. En total se incubaron 7 bolsas por cada vaca, alimento y tiempo de incubación. Se realizaron 2 series de incubaciones, en cada serie se incubaron por cada vaca 56 bolsas (día 1 y 7 del periodo de mediciones). Las bolsas fueron incubadas en el rumen una hora luego de la oferta del concentrado y durante 0, 3, 6, 12, 24, 36, 48 y 72 h. Luego de retiradas del rumen, eran inmediatamente lavadas en forma manual con agua corriente por 5 min y congeladas (-18°C). Adicionalmente, bolsas no incubadas, correspondientes a la hora 0, también fueron lavadas hasta obtener agua clara y congeladas. Posteriormente todas las bolsas fueron descongeladas, lavadas en agua corriente, colocadas en estufa a 55 ºC durante 48 h, pesadas y almacenadas para posterior análisis. Se determinó el contenido de N de cada bolsa. Para el cálculo de las fracciones soluble y potencialmente degradable (a y b respectivamente), y de las tasas de degradación proteica los datos de cada bolsa incubada fueron modelizados según un modelo exponencial (Orskov y McDonald, 1979) (Ecuación 1):
La degradabilidad efectiva (DE) de los alimentos fue estimada con los parámetros obtenidos in situ, asumiendo una tasa de pasaje (kp) de 6%/h, y utilizando la siguiente ecuación (Orskov y McDonald, 1979) (Ecuación 2):
Producción de gas in vitro
Fue realizado un ensayo de producción de gas in vitro (Mauricio y col., 1999). Se realizaron 3 corridas independientes, en cada corrida 0,5 g de muestra fueron pesados y colocados en frascos de vidrio de 125 mL (3 frascos por muestra y corrida). Se agregaron a cada frasco 40 mL de solución buffer (Mould y col., 2005), a continuación, fueron tapados y mantenidos refrigerados a 4°C durante 12 h antes de la inoculación para permitir la hidratación del sustrato. Previo a la inoculación de los frascos con líquido ruminal (inóculo), los mismos fueron llevados a un baño de agua a 39°C donde se mantuvieron por todo el periodo de mediciones. Inmediatamente tras la inoculación (10 mL), cada frasco fue tapado con septo de goma de butilo. Todas las manipulaciones se realizaron bajo un flujo de CO2. Además, 3 frascos de fermentación sin sustrato fueron incluidos como blancos para corregir la fermentación propia del inóculo. Se registró la presión interna de los frascos a las 3, 6, 12, 24, 36, 48 y 72 h de incubación mediante un manómetro 840065 (Sper Scientific®, Redfield Rd#7 Scottsdale, AZ 85260) y una aguja hipodérmica. Luego de cada lectura el gas fue eliminado de los frascos. Los datos de presión de gas (psi) registrados fueron transformados a volumen (V) mediante la ecuación de predicción obtenida en un experimento previo (Ecuación 3):
La producción de gas acumulada fue calculada, a partir de los datos de presión, y ajustada al siguiente modelo (Orskov y McDonald, 1979) (Ecuación 4):
Degradabilidad ruminal in vitro de la proteína
La degradabilidad ruminal de la proteína fue estimada a través del amoniaco liberado in vitro (Broderick, 1987, modificada por Fernandez-Turren, 2016). Brevemente, la modificación consiste en que se evalúa únicamente la producción de amoniaco, asumiendo que la captación por parte de las bacterias es mínima en comparación a la producción de amoniaco cuando se evalúan sustratos proteicos. Además, la muestra incubada se considera libre de nitrógeno soluble, asumiendo que luego del proceso de solubilización, quedaría únicamente la fracción potencialmente degradable en rumen e indegradable. Para el presente trabajo, el procedimiento fue igual al realizado en el ensayo de producción de gas in vitro, partiendo de una muestra sin N soluble. El contenido de cada frasco de fermentación fue muestreado (0,5 mL) a las 0, 6, 12, 18, 24, 36, 48 y 72 h desde el comienzo de la incubación mediante una jeringa de insulina. La muestra se almacenó en 2,5 mL de ácido sulfúrico (2% v/v), y posteriormente se congelaron hasta la determinación de amoniaco mediante colorimetría (Weatherburn, 1967). Los valores de liberación de amoniaco (Amoniaco liberado) fueron calculados como proporción de la concentración de amoniaco en cada horario con respecto al N incubado en cada frasco (Ecuación 5):
La fracción de N soluble in vitro (NS) se determinó por diferencia entre la concentración de nitrógeno de la muestra y la obtenida luego de incubar el alimento durante 3 h en agua destilada con agitación lenta a temperatura ambiente, empleando 10 g de muestra en 1 litro de agua destilada, y posterior lavado con agua corriente (Ecuación 6).
La proporción degradable de la proteína en cada tiempo de incubación fue calculada según la siguiente ecuación (Ecuación 7):
La tasa de degradación proteica in vitro (TD) fue estimada como el coeficiente de regresión entre el logaritmo natural de la proporción indegradable de la proteína (Ln (1-DNIV)) y el tiempo de incubación (horas) (Broderick, 1987).
La degradabilidad efectiva in vitro (DE-N) fue estimada con los parámetros obtenidos in vitro, asumiendo una tasa de pasaje (kp) de 6%/h, y utilizando la siguiente ecuación (Orskov y McDonald, 1979) (Ecuación 8):
Análisis de composición química
Se analizaron los contenidos de MS, materia orgánica (MO), nitrógeno total (N), nitrógeno insoluble en detergente neutro (NIDN), nitrógeno insoluble en detergente ácido (NIDA), EE, FND y fibra ácido detergente (FAD) de las muestras de harina y expeller de soja evaluadas. Los contenidos de MS, MO y N fueron analizados según los métodos ID 934.01, ID 942.05 e ID 968.06 respectivamente (AOAC, 2000). Los contenidos de NIDN y NIDA también fueron analizados (Licitra y col., 1996). Los contenidos de FND y FAD fueron analizados secuencialmente (Robertson y Van Soest, 1981) utilizando un analizador de fibras Ankom (Ankom Technology Corporation, Fairport, NY, USA) y expresados excluyendo la ceniza residual. El análisis de FND fue realizado sin la utilización de alfa amilasa. El contenido de EE fue determinado para todas las muestras (AOCS, 2005).
Análisis estadístico
La comparación de medias fue realizada a través de análisis de varianza utilizando el procedimiento MIXED del SAS® (versión 9.0, SAS Institute Inc., Cary, NC).
La composición química de los subproductos fue comparada de acuerdo al modelo (Ecuación 9):
La cinética de degradación ruminal fue analizada por un modelo de regresión no lineal utilizando el procedimiento NLIN del SAS® (SAS 9.0V, SAS Institute Inc., Cary, NC).
Los parámetros de degradación fueron comparados entre tratamientos de acuerdo al modelo (Ecuación 10):
Los parámetros de producción de gas in vitro y liberación de amoniaco in vitro fueron comparados como medidas repetidas en el frasco de acuerdo al modelo (Ecuación 11):
Las medias fueron comparadas utilizando el test de Tukey. Diferencias significativas se declararon cuando P≤0,05, y se consideró una tendencia cuando 0,05<P≤ 0,10.
Simulación en software NRC (2001)
Los datos medios de composición química y degradabilidad ruminal in situ obtenidos en este trabajo para harinas y expeller fueron incluidos en el programa NRC (NRC, 2001). Se simuló una situación productiva considerando vacas lecheras de alta producción en su pico de lactancia, produciendo 40 kg de leche/día, con 3,4% de grasa, 3,0% de proteína y 4,8% de lactosa. Se evaluó una dieta de uso común en los sistemas lecheros nacionales, compuesta por 12 kg de silo de maíz, 8 kg de grano húmedo de maíz, 4,5 kg de subproductos de soja y núcleo mineral. Se realizaron 4 simulaciones en el software, donde el único componente que varió en la dieta fue el subproducto de soja empleado en la simulación (i.e. harina o expeller evaluados y harina o expeller incluidos en la biblioteca de alimentos del NRC).
Resultados
El contenido de MS, FND, FAD y NIDN fue similar entre los subproductos de soja. En cambio, las harinas presentaron mayor contenido de PB y NIDA con respecto a los expeller, pero un menor contenido de EE (P<0,05, Tabla 1).
Tabla 1: Tipo y composición química (expresado cómo % de la MS) de los subproductos de soja muestreados.

Las harinas presentaron menor fracción soluble de la MS (P<0,001), pero mayor tasa de degradación y DE in situ, tanto de la MS (P <0,05) como de la PB (P<0,05), comparado con los expeller (Tabla 2).
El volumen de gas producido (V) y el tiempo de latencia en la producción de gas (L) no presentaron diferencias entre harinas y expeller (P=0,296 y P=0,438, respectivamente), sin embargo, la tasa de producción de gas (c) varió, siendo mayor para las harinas de soja (P<0,01; Tabla 2).
Los parámetros de degradabilidad ruminal in vitro obtenidos a partir de la liberación de amoniaco en cada frasco de fermentación fueron similares entre los subproductos evaluados (Tabla 2).
Tabla 2: Parámetros de degradabilidad ruminal in situ de la MS y PB, producción de gas in vitro y degradabilidad ruminal in vitro de harinas y expeller de soja (n = 8). Datos expresados en % a no ser que se indique expresamente.

Los resultados de la simulación de las dietas utilizando el software se presentan en la Tabla 3. Para un mismo consumo de MS total (21,8 kg MS/día), el balance de proteína metabolizable es muy distinto entre los subproductos evaluados y los presentes en la base de datos. Se obtendrían hasta 5 litros de leche /día menos cuando se sustituye la composición de las harinas del NRC por la composición de las harinas evaluadas.
Discusión
En general, los valores de PB, EE y FND, obtenidos para las muestras relevadas en este trabajo, se encuentran dentro de lo esperado (Alderman y Cottrill, 1993; NRC, 2001). Sin embargo, se encontraron menores valores de NIDA con respecto a lo publicado (NRC, 2001). Como era de esperar, los expeller, debido al proceso de extracción mecánica, presentaron mayor cantidad de aceite y menor porcentaje de PB que las harinas, obtenidas por extracción con solventes. Esta diferencia se debe principalmente a la mayor eficiencia en la extracción del aceite por parte de los solventes en comparación al proceso mecánico (NRC, 2001).
Los elevados valores de degradabilidad ruminal de la proteína obtenidos para las harinas de soja evaluadas se explicarían por las elevadas tasas de degradación ruminal obtenidas. Este resultado es llamativo y debería tomarse en cuenta sobre todo cuando se espera que provean proteína de pasaje. Valores elevados de tasas de degradación, similares a las registradas, han sido reportadas en la bibliografía para harinas que fueron sometidas a tratamiento térmico menos intenso (Borucki Castro y col., 2007). Es sabido que los tratamientos térmicos provocan una desnaturalización parcial de las proteínas, la cual consiste en la pérdida de las estructuras terciaria y/o cuaternaria, disminuyendo la degradabilidad ruminal de la proteína y subsecuentemente un incremento en el flujo de AA al duodeno (Stern y col., 1985). Para aumentar el flujo de proteína de pasaje sin incrementar el nivel de proteína indigestible el proceso térmico debe realizarse de manera adecuada, ya que el calentamiento excesivo favorece la aparición de reacciones de Maillard como se mencionó anteriormente. Por otra parte, los expeller en general contienen una menor fracción soluble y una menor tasa de degradación ruminal que las harinas debido al proceso térmico (Goelema y col., 1999). Sin embargo, en este experimento únicamente se registró una menor tasa de degradación con respecto a las harinas. Sin embargo, no se detectaron diferencias en la fracción soluble, lo que podría deberse a variaciones en el procesamiento industrial que sufrieron las materias primas y que se desconocen.
La fracción de N soluble (a) obtenida in situ a partir de todos los subproductos de soja fue baja (10-12%) en relación a otras fuentes de proteína como pasturas o reservas forrajeras que constituyen la base de la alimentación en los sistemas lecheros de Uruguay. En este tipo de alimentos la fracción de N soluble varía entre 35-45% para pasturas templadas, y alcanza valores de 59,7% en el caso de los ensilajes de leguminosas (Cohen, 2001; Repetto y col., 2005). A pesar de lo anterior, ambos subproductos presentaron un elevado porcentaje de proteína degradable en rumen in situ, por lo que a la hora de complementar el aporte de N de las pasturas debería ser considerado este parámetro, ya que el nivel de proteína de pasaje podría estar reducido.
Los valores de tasa de producción de gas in vitro se correspondieron con los obtenidos para la tasa de degradabilidad ruminal, lo cual resulta lógico considerando que la producción de gas in vitro es un indicador indirecto del potencial de fermentación de los alimentos (Rymer y col., 2005). Por lo tanto, la técnica de producción de gas in vitro podría considerarse como un método rápido y económico para evaluar la degradabilidad ruminal de este tipo de alimentos.
Las diferencias detectadas en la tasa de degradación in situ no se lograron detectar in vitro, a través de la medición de la liberación de amoniaco. Por lo tanto, en este caso parecería ser que la velocidad de desaparición de la proteína, evaluada con la técnica in situ, fue diferente a la tasa de producción de amoniaco. Al respecto, es necesario considerar que en todo el proceso de degradación proteica hasta amoniaco participan diferentes grupos bacterianos por lo cual, la producción de amoniaco resulta un proceso más complejo que la desaparición de contenido de las bolsas (Bach y col., 2005). Aún son necesarios más trabajos que permitan una mejor aproximación a los procesos de degradación ruminal de las proteínas. Consideramos que las técnicas empleadas en este estudio, además de presentar bajo costo y alta capacidad analítica, podrían llegar a brindar información complementaria.
En cuanto a la simulación realizada en el NRC (NRC, 2001), uno de los resultados más interesantes es el impacto en la producción de leche cuando se incluyen en la dieta los valores correspondientes a los subproductos presentes en Uruguay. En este sentido, se lograría una producción de leche 12,3% menor si se utiliza el dato de composición química y degradabilidad ruminal de la harina de soja evaluada, mientras que para los expeller esa diferencia sería menor (5,26%). Esta diferencia en producción se explicaría por la mayor degradabilidad ruminal de las harinas respecto a los expeller (disminución de la proteína de pasaje) más que a diferencias en el contenido de proteína.
Los subproductos de soja analizados presentaron alta degradabilidad ruminal, con una diferencia notoria en la velocidad de degradación sin apreciarse diferencias en la fracción soluble tanto in situ como in vitro. La ausencia de diferencias en este parámetro podría estar vinculado a las condiciones de procesamiento industrial. Serían necesarios más estudios que profundicen en las causas de la alta degradabilidad ruminal de los subproductos de soja nacionales y aquellos que ingresan al país.
Conclusiones
A pesar del reducido número de muestras analizadas en este trabajo y de las diferencias de resultados obtenidos entre las metodologías in situ e in vitro, podemos concluir que las harinas de soja presentaron menor contenido de extracto etéreo y mayor porcentaje de proteína bruta, con una mayor degradabilidad ruminal de la proteína respecto a los expeller. A su vez, los subproductos evaluados presentaron mayor degradabilidad ruminal en comparación a los datos que se manejan en el NRC (NRC, 2001). Estas diferencias deberían ser tenidas en cuenta por los nutricionistas a la hora de formular dietas.