Stewart Silvina¹

¹INIA La Estanzuela. Ruta 50 km 11, 70006 Colonia, Uruguay. Correo electrónico: sstewart@inia.org.uy

Recibido: 30/5/14 Aceptado: 27/4/15

Sesenta aislamientos de los hongos pertenecientes al complejo Diaporthe/Phomopsis de la soja fueron caracterizados utilizando morfología clásica y PCR-RFLP para determinar especie y variedad dentro de la especie. Algunos de los atributos morfológicos estudiados se asocian a cierta variedad dentro del complejo Diaporthe/Phomopsis. Utilizando PCR-RFLP, 37 aislamientos fueron identificados como Diaporthe phaseolorum var. sojae, 19 como D. p. var. caulivora y 4 como D. p. var. meridionalis. Si bien se determinó que las dos variedades de Diaporthe phaseolorum causales de cancro del tallo coexisten en nuestro país, el 83 % de los aislados fueron identificados como D. p. var. caulivora. Esta predominancia tiene implicancias directas en el manejo de la enfermedad, debido a que los genes de resistencia incorporados a los cultivares comerciales de soja que le confieren resistencia a cancro del tallo no son efectivos para controlar esta variedad del hongo.

Palabras clave: DIAPORTHE PHASEOLORUM, CAULIVORA, MERIDIONALIS, PHOMOPSIS

Summary

Characterization of the Causal Agent of Stem Canker of Soybean in Uruguay

Sixty isolates of fungi belonging to the Diaporthe/Phomopsis complex in soybean were characterized using classical morphology and PCR-RFLP to determine species and varieties within the species. Some of the morphological attributes studied were associated to certain variety within the complex Diaporthe/Phomopsis. Using PCR-RFLP, 37 isolates were identified as Diaporthe phaseolorum var. sojae, 19 as D. p. var. caulivora, and 4 as D. p. var. meridionalis. Despite the fact that both varieties of Diaporthe phaseolorum causing stem canker coexist in our country, 83 % of the isolates were identified as D. p. var. caulivora. This predominance has direct implications on disease management, since resistant genes incorporated in most available soybean cultivars to control stem canker are not effective against this variety of the fungus.

Introducción

Durante la zafra 2012/13 el cultivo de soja en el Uruguay fue afectado por una enfermedad llamada cancro del tallo, con incidencias medidas en chacra de hasta 35-40 % (Stewart, no publicado). En el mundo y en la región, esta enfermedad es causada por dos variedades del hongo Diaporthe phaseolorum (Cooke & Ellis) Sacc.: D. phaseolorum var. meridionalis Fernández & Hanlin y D. phaseolorum var. caulivora Athow & Cadwell (Fernandez et al., 1999; Pioli et al., 2003; Yorinori, 1996). Estas dos variedades del hongo, además de D. phaseolorum var. sojae (Lehman) Wehmeyer agente causal del tizón de la vaina y el tallo, y Phomopsis longicolla Hobbs, agente causal de la pudrición de semilla de soja, forman el complejo Diaporthe/Phomopsis de la soja. En nuestro país, el único hongo de este complejo debidamente reportado es D. phaseolorum var. sojae (Monteiro et al., 1984), no habiendo reportes previos de cancro del tallo.

Durante la década de 1970, el cancro del tallo fue detectado por primera vez en los estados del sur de Estados Unidos y el organismo causal fue identificado como D. phaseolorum var. caulivora (Backman et al., 1981; Snow et al., 1984). En 1992 se evaluó la patogenicidad de los aislados del sur y del norte de EUA, llegando a distinguir razas fisiológicas y diferencias en preferencias de temperatura entre los mismos, que posteriormente dieron lugar a la diferenciación entre D. phaseolorum var. meridionalis (cancro del sur de EUA) y D. phaseolorum var. caulivora (cancro del norte de EUA) (Keeling, 1982, 1984, 1988; Morgan Jones, 1989), y a la clasificación como variedades del hongo. En Argentina, en 1992, se determinó que el cancro del tallo era causado por D. phaseolorum var. meridionalis (Ivancovich, 1992), extendiéndose luego a la zona núcleo de producción de granos de soja (Pioli et al., 1997). En 1999 se identifica por primera vez a D. phaseolorum var. caulivora en la provincia de Santa Fe (Pioli et al., 2001) y se afianza como agente predominante del cancro del tallo, debido a la disponibilidad de genotipos de soja con resistencia a D. phaseolorum var. meridionalis (Pioli et al., 2002). En 2005 surge de forma epidémica en Buenos Aires con una prevalencia del 94 % e incidencias de hasta 55,5 % en el centro y sureste bonaerense (Grijalba et al., 2011; Lago, 2010). En Brasil, el cancro del tallo fue identificado por primera vez en 1989, causado por D. phaseolorum var. meridionalis, llegando a ocasionar pérdidas de hasta 100 % (Yorinori, 1996). Posteriormente, en 2006, se encuentra la forma D. phaseolorum var. caulivora en Rio Grande do Sul (Costamilan et al., 2008).

La determinación de la variedad del hongo es importante porque hay cuatro genes mayores conocidos en soja que confieren resistencia a D. phaseolorum var. meridionalis (Rdm1-Rdm4), pero no confieren resistencia a la variedad D. phaseolorum var. caulivora (Pioli et al., 2003). El cancro del tallo causado por D. phaseolorum var. meridionalis se maneja a través de resistencia genética, es así que la mayoría de las variedades comerciales de soja presentan en su descripción varietal la caracterización frente a esta enfermedad (resistente, susceptible o tolerante a cancro del tallo). Contrariamente, no se han detectado hasta el momento genotipos de soja resistentes a D. phaseolorum var. caulivora (Grijalba et al., 2011). Sin embargo la evaluación de numerosos genotipos procedentes de diferentes fuentes de germoplasma de soja indican posibles fuentes de resistencia a esta variedad (Pioli et al., 2012).

La determinación de la variedad del hongo mediante caracteres morfológicos es dificultosa, las características son altamente variables y muchas veces no permite establecer claras diferencias taxonómicas (Pioli et al., 2003; Zhang et al., 1998). Algunas de las características morfológicas propuestas para la identificación son: color y apariencia de la colonia, tamaño y forma del estroma, tamaño de los conidios α y β, y tamaño y arreglo de peritecios (Grijalba et al., 2011; Zhang et al., 1998). Para la reproducibilidad de algunos de estos atributos morfológicos se debería asegurar la repetitividad en las condiciones y los medios de cultivo utilizados (Fernandez y Hanlin, 1996). Con el objetivo de sortear estas dificultades, Zhang et al. (1998) desarrollan una técnica molecular basada en la amplificación del fragmento ITS del ADN ribosomal nuclear con el posterior uso de enzimas de restricción (PCR-RFLP). Esta técnica separa las especies del complejo Diaporthe/Phomopsis y diferencia con exactitud entre las variedades D. phaseolorum var. meridionalis y D. phaseolorum var. caulivora.

El objetivo de este trabajo fue determinar el agente causal del cancro del tallo en Uruguay, utilizando la técnica de PCR-RFLP y la identificación morfológica tradicional.

Procedencia y obtención de los aislados

Se recuperaron un total de 60 aislados; un aislado obtenido de tallo afectado de la zafra 2011/2012, uno de semilla zafra 2011/2012, 57 de tallos afectados de la zafra 2012/13, y uno de raíz de la zafra 2012/13. Las muestras provinieron de 32 chacras en los departamentos de Colonia, Flores, Rivera, San José, Soriano y Treinta y Tres. Para la obtención de los aislados la parte afectada del tallo fue puesta en cámara húmeda, luego de uno a cinco días se procedió a cortar a lo largo del tallo una lámina de la corteza hasta dejar expuesta la parte interna de los peritecios y/o picnidios, con una aguja flameada se extrajo el contenido de la estructura y se lo transfirió a PDA ácido (1 L de solución colada proveniente de 200 g papas hervidas, 10 g dextrosa, 20 g agar, tres gotas de ácido láctico al 25 % por placa de Petri). Todos los aislados fueron purificados utilizando el método de punta de hifa (French y Herbert, 1980), y fueron conservados a 4 ºC en tubos con PDA.

Extracción de ADN

Se utilizó un procedimiento de extracción CTAB modificado (Doyle y Doyle, 1987). Brevemente, se raspó el micelio de una placa de PDA con 8-10 días de crecimiento, se agregó 700 µl de buffer de extracción, se mezcló y se incubó a 65 ºC por 60 min. Se dejó enfriar a temperatura ambiente, se agregó 700 µl de cloroformo isoamílico 24:1, mezclando suavemente. Se centrifugó 20 min a 3000 rpm, se pasó el sobrenadante a tubo nuevo y se repitió dos veces. Se agregó 500 µl de isopropanol y se dejó 2 h a 4 ºC. Se centrifugó a 5000 rpm por 20 min, se descartó el sobrenadante y se agregó 200 µl de etanol 70 %, se repitió dos veces. Se invirtió el tubo, se dejó secar, y se resuspendió en 150 µl ddH₂O estéril.

Amplificación de la región ITS y RFLPs

Se utilizaron los cebadores universales ITS4 e ITS5 para amplificar la región ITS del ADN ribosomal nuclear en un ciclador MultiGene Thermalcycler (Labnet International, Inc.). Se utilizó un mix de 1 mM MgCl₂; 0,2 mM de dTTP, dAPT, dFTP, y dCTP; 0,5 pmol de los cebadores ITS 4 e ITS 5; 0,5 unidades de Taq polimerasa (HydroPol ^TM Bioline USA, Inc.) y 1 ¼ de ADN genómico para llegar a un volumen final de 20 ¼. El PCR se llevó a cabo con un ciclo de 96 ºC durante 3 min, y 24 ciclos de 94 ºC 1 min, 60 ºC por 1 min y 72 ºC por 2 min, luego 72 ºC por 4 min. El producto de PCR fue cortado con las enzimas de restricción Alu I (Biolabs, Inglaterra) y Rsa I (Bioron, Alemania) siguiendo el protocolo del proveedor. Los productos de amplificación se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1,5 % y se detectaron con Gel Red ^TM o GoodView ^TM visualizandose bajo luz ultravioleta; se utilizó un marcador molecular de 1-kb ADN de doble hebra.

Determinación morfológica

Los aislados fueron transferidos a PDA con tallos de soja estériles para inducir la formación de las estructuras sexuales y fueron incubados a 25 ºC en la oscuridad por 30-40 días (Pioli et al., 2003). Se caracterizó la morfología de la colonia: color, tipo de micelio, presencia y tipo de estroma, presencia de picnidios, presencia y tipo de conidio, presencia y tipo de agrupamiento de peritecios, presencia y forma del cuello del peritecio (Pioli et al., 2003). ]]>

Análisis de datos

Se realizó un análisis de correspondencia múltiple, utilizando PROC CORRESP en SAS versión 9.2 (SAS Institute, Cary, NC), entre las características morfológicas y el resultado de la identificación molecular de cada aislado. Previamente, a cada característica morfológica se le asignaron dos o tres atributos, basados en descripciones tomadas de la bibliografía (Zhang et al., 1998; Pioli et al., 2003) y en diferencias observadas a simple vista o con el uso de una lupa binocular y/o microscopio. Al carácter color se le asignaron dos atributos: blanco-grisáceo y blanco-amarronado. Al tipo de micelio se le asignaron tres atributos: micelio esponjoso, con hebras y con motas. Al tipo de estroma se le asignaron tres atributos: ausencia de estroma, estroma localizado y estroma extendido. A picnidios se le asignaron dos atributos; ausencia o presencia. A conidios se le asignaron tres atributos: ausencia, conidios tipo a y conidios tipo b. Los peritecios tienen como atributos ausencia y presencia de peritecios solitarios o agrupados. Al cuello del peritecio se le asignaron: ausencia o presencia de cuello largo y fino o corto y grueso.

Resultados

Se amplificó el ADN de los 60 aislados en sucesivas corridas, todos ellos produjeron una banda de aproximadamente 600 pb. La enzima Alu I digirió 56 de los productos de PCR provenientes de la amplificación del ADN de los 60 aislados; de estos, 36 aislados presentaron dos bandas de 458/146 pb, 19 tres bandas de 281/176/145 pb y 1 tres bandas de 339/146/124 pb (Figura 1, Cuadros 1 y 2). Por el contrario, la misma enzima no digirió el producto de PCR proveniente de la amplificación del ADN de cuatro de los 60 aislados. La enzima Rsa I no digirió el ADN de ninguno de los productos de amplificación de los 60 aislados. Utilizando el criterio de patrón de bandas asociado a la especie/variedad del hongo de Riccioni (2009) y de Zhang et al. (1998) (Cuadro 1) se pudieron identificar y discriminar los 60 aislados estudiados en 37 D. phaseolorum var. sojae, 19 D. phaseolorum var. caulivora y 4 D. phaseolorum var. meridionalis (Cuadro 2).

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Veintitrés de los 60 aislados (38,3 %) fueron determinados como pertenecientes al complejo Diaporthe/Phomopsis causales de cancro del tallo. Entre ellos, el 82,6 % resultó de la variedad del hongo D. phaseolorum var. caulivora.

En general las características morfológicas evaluadas coinciden con las determinadas para cada especie y/o variedad del hongo. A pesar de ello, varios de los aislados presentaron características confusas o solapadas (color, agrupación de peritecios) con otros miembros del complejo Diaporthe/Phomopsis. Además, algunas estructuras nunca se formaron, como fue el caso de los picnidios en algunos aislados de D. phaseolorum var. Sojae

Algunos de los atributos morfológicos estudiados se asocian más a cierta variedad del hongo que a otra, y explican un 46 % de la varianza o de la inercia acumulada (Figura 2). Es el caso de D. phaseolorum var. caulivora con el color blanco-amarronado, el micelio formando motas y la presencia de peritecios agrupados. La presencia de picnidios con conidios tipo a se asocia más a D. phaseolorum var. meridionalis; y el color blanco-grisáceo, la ausencia de peritecios y de sus respectivos cuellos y la presencia de estroma extendido se asocian más a D. phaseolorum var. sojae. Estos dos últimos integrantes del complejo parecen ser más parecidos morfológicamente entre ellos, aunque esta similitud podría estar influenciada por el bajo número de aislados de D. phaseolorum var. meridionalis estudiados.

Discusión

Este es el primer reporte de cancro del tallo de la soja en el país. En este trabajo se logra identificar tres integrantes del complejo Diaporthe/Phomopsis; D. phaseolorum var. sojae agente causal del tizón de la vaina y el tallo, y los dos agentes causales del cancro del tallo D. phaseolorum var. meridionalis y D. phaseolorum var. caulivora.

Si bien hubo atributos morfológicos de los aislados que se asociaron más a una variedad del hongo que a otra, no hubo una delimitación clara si se considera que un factor está bien representado en el espacio cuando la suma de sus contribuciones o la inercia acumulada es al menos un 60 %, mejor aún un 75 % (Bendixen, 2003). En este trabajo las dos dimensiones explican tan solo un 46 % de la varianza o de la inercia acumulada, por lo que las características morfológicas utilizadas no serían suficientemente certeras como para delimitar especies o variedades dentro del complejo Diaporthe/Phomopsis. Son varios los autores que han mencionado solapamientos de las características morfológicas entre aislados de distintas especies dentro del complejo Diaporthe/Phomopsis, además de aislados atípicos e incongruencias en la morfología (Grijalba et al., 2011; Pioli et al., 2003; Yorinori 1991; Zhang et al., 1998). Por otro lado, la técnica de PCR-RFLP propuesta es sencilla y discrimina fácilmente entre especies/variedades del hongo.

El agente causal del cancro del tallo más frecuentemente recuperado (>80 %) de los tallos fue D. phaseolorum var. caulivora. Se concluye que si bien en el país están presentes ambas variedades de Diaporthe phaseolorum, la variedad caulivora fue la que predominó, por lo que la epidemiología de la enfermedad se asemejaría a la del cancro del norte de EUA (Keeling, 1984, 1988).

La predominancia de D. phaseolorum var. caulivora podría estar asociada con las diferencias en los requerimientos de temperatura (o rangos de temperaturas óptimas) entre las variedades del hongo. El hongo D. phaseolorum var. caulivora prefiere temperaturas más frescas, entre 20 y 25 ºC, mientras que D. phaseolorum var. meridionalis prefiere temperaturas más cálidas, entre 25 y 30 ºC (Keeling, 1988). Esto coincide con que el 98 % de los aislados estudiados provienen del sur de nuestro país, con temperaturas medias relativas más frescas durante la zafra que en el norte del país.

Asimismo, los resultados podrían estar asociados indirectamente con la presión de selección ejercida por el uso de la resistencia a D. phaseolorum var. meridionalis, incorporada en casi todas las variedades de soja utilizadas comercialmente en nuestro país que provienen de Argentina. Los genes de la soja que confieren resistencia a D. phaseolorum var. meridionalis no determinan resistencia a D. phaseolorum var. caulivora (Pioli et al., 2003; Pioli, 2011), lo que tiene grandes implicancias para el manejo de la enfermedad, dado que aquellas variedades que aparecen caracterizadas como resistentes al cancro del tallo en realidad no serán resistentes a la variedad del hongo causal del cancro del tallo en Uruguay.

Agradecimientos

A Marcelo Rodríguez por su dedicación en las distintas etapas de este proyecto, a Wilfredo Ibáñez por su asesoramiento estadístico, a Paula Silva y Luciana Landechea del laboratorio de biotecnología de La Estanzuela por su asesoramiento y buena disposición, y a los revisores por sus sugerencias.

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