ARTÍCULO ORIGINAL
 

Efecto del poscondicionamiento isquémico sobre las arritmias de reperfusión en un modelo de hipertrofia miocárdica 

EMILIANO RAúL DIEZ ¹, NATALIA JORGELINA PRADO ², AMIRA ZULMA PONCE ZUMINO ³,
DR. ROBERTO MIGUEL MIATELLO ⁴ 

1. Médico. Auxiliar Docente de Fisiología Normal. Facultad de Ciencias Médicas. UNCuyo
2. Estudiante. Becaria Promoción a la Investigación. UNCuyo. ]]> 3. Médica. Profesora Consulta. UNCuyo.
4. Profesor Adjunto de Fisiopatología Patológica. Facultad de Ciencias Médicas. UNCuyo.
Correspondencia: Emiliano R. Diez. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Cuyo. Av. del Libertador 80, Parque General San Martín. Mendoza, Argentina.
La fuente de apoyo en forma de subvenciones: Subsidios de la UNCuyo, 06/J326 y 06/J320
Recibido marzo 30, 2011; aceptado junio 14, 2011. 

RESUMEN 

Introducción: el poscondicionamiento isquémico (PCI) es una estrategia protectora contra la injuria por reperfusión con propiedades antiarrítmicas. La hipertrofia cardíaca secundaria a la hipertensión arterial aumenta el riesgo de sufrir arritmias y, además, reduce la respuesta a algunos tratamientos.
Objetivo: determinar si el efecto antiarrítmico del PCI se mantiene en corazones hipertróficos.
Método: los corazones aislados de ratas Wistar Kyoto (WKY) y de ratas espontáneamente hipertensas (SHR) de la misma edad, fueron perfundidos según la técnica de Langendorff y sometidos a 15 min de isquemia regional. Al momento de la reperfusión se dividieron en: a) WKY, b) WKY-PCI, c) SHR, d) SHR-PCI (n=13 por grupo). El PCI consistió en tres ciclos de 30 s de reperfusión y 30 s de isquemia, al inicio de la reperfusión. Se clasificaron las arritmias ventriculares observadas en el ECG. Se estimó la hipertrofia por el peso cardíaco relativo. ]]> Resultados: la hipertensión arterial en las ratas SHR provocó hipertrofia miocárdica. Todos los corazones sufrieron una alta incidencia de fibrilación ventricular al inicio de la reperfusión (SHR 92,3% y WKY 77%, ns). El PCI restituyó el ritmo sinusal en los corazones de las ratas normotensas (WKY-PCI 61,5% vs WKY 23,1%, p=0,0236 por test de C²) y en los de las SHR (SHR-PCI 69,2% vs SHR 15,4%, p=0,0016 test de C²).
Conclusión: el PCI fue capaz de restituir el ritmo sinusal en la mayoría de los corazones que presentaron arritmias ventriculares de reperfusión y el efecto antiarrítmico se mantuvo en corazones hipertróficos provenientes de ratas SHR. 

PALABRAS CLAVE:
  nARRITMIAS CARDíACAS
    DAÑOS POR REPERFUSIÓN MIOCÁRDICA
    POSTCONDICIONAMIENTO ISQUÉMICO
    RATAS CONSANGUÍNEAS SHR 

SUMMARY 

Introduction: ischemic postconditioning (IPC) is a protective strategy against reperfusion injury with antiarrhythmic properties. Cardiac hypertrophy secondary to hypertension increases the risk of arrhythmias and also reduces the response to some treatments. ]]> Objective: to determine whether the antiarrhythmic effect of IPC was maintained in hypertrophic hearts.
Methods: isolated rat hearts from Wistar Kyoto rats (WKY) and spontaneously hypertensive rats (SHR) of the same age, were perfused according to Langendorff technique and subjected to 15 min regional ischemia. At the moment of reperfusion, hearts were divided into: a) WKY, b) WKY-IPC, c) SHR, d) SHR-IPC (each group, n= 13). The IPC consisted of 3 cycles of 30 s of reperfusion and 30 s of ischemia at the onset of reperfusion. Ventricular arrhythmias were diagnosed using ECG records. Hypertrophy was estimated by relative heart weight.
Results: hypertension in SHR induce myocardial hypertrophy. All hearts underwent a high incidence of ventricular fibrillation (SHR 92,3% and WKY 77%, ns). IPC restored sinus rhythm in the hearts of normotensive rats (WKY-PCI 61,5% versus WKY 23,1%, p = 0,0236 by C² test) and in those from SHR (SHR-PCI 69% versus SHR 15,4%, p = 0,0016 C² test).
Conclusion: IPC is able to restore sinus rhythm from most of the hearts that developed reperfusion ventricular arrhythmias and the antiarrhythmic effect remains in hypertrophic hearts from SHR rats.
 

KEYWORDS:
    ARRHYTHMIAS, CARDIAC
    MYOCARDIAL REPERFUSION INJURY
    ISCHEMIC POSTCONDITIONING
    RATS, INBREAD SHR 

INTRODUCCIóN 

Las taquiarritmias ventriculares que ocurren durante la reperfusión del miocardio isquémico son un marcador de mal pronóstico. Si bien la cardioversión eléctrica es efectiva para restituir el ritmo sinusal, la mortalidad a 30 y 90 días está sustancialmente elevada en aquellos pacientes que recibieron este tratamiento ^(1,2). Se cree que este peor pronóstico podría interpretarse como la expresión de la injuria por isquemia/reperfusión, ya que la incidencia de arritmias se asocia con el daño microvascular y con infartos de mayor tamaño ⁽³⁾. Dado que la cardioversión no protege contra los efectos producidos por la isquemia/reperfusión, es necesario desarrollar tratamientos antiarrítmicos que además sean protectores contra otros componentes de esta injuria. 

El poscondicionamiento isquémico (PCI) es una maniobra cardioprotectora con propiedades antiarrítmicas ^(4-7). El mismo consiste en aplicar breves episodios de isquemia intermitente al inicio de la reperfusión. Esta maniobra fue descripta en 2003 por Zao y colaboradores, quienes demostraron que reduce el tamaño del infarto y la disfunción endotelial en corazones in situ de perros ⁽⁴⁾. Esto fue rápidamente confirmado como cardioprotector en el ámbito clínico ⁽⁵⁾. Recientemente se ha demostrado que protege contra las arritmias de reperfusión en ratas y que este efecto se mantiene en corazones de ratas senescentes ^(6,7). 

La hipertrofia cardíaca secundaria a hipertensión arterial aumenta el riesgo de sufrir arritmias y reduce la respuesta a algunos tratamientos. Las modificaciones miocárdicas estructurales y funcionales que ocurren debido a la hipertensión arterial predisponen a la ocurrencia de arritmias ventriculares severas ⁽⁸⁾. Algunas estrategias cardioprotectoras, como la administración de enalapril o el mismo PCI son menos efectivas en corazones hipertróficos ^(9,12). 

Por lo antes expuesto decidimos evaluar si el efecto antiarrítmico del PCI se mantiene en corazones hipertróficos provenientes de ratas espontáneamente hipertensas. 

MATERIAL Y MéTODO 

MODELO EXPERIMENTAL 

Los experimentos se realizaron en corazones aislados de ratas de acuerdo a los procedimientos dispuestos por el CICUAL de la Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Cuyo, que constata que los estudios se ajusten a la Guía de Cuidado y Uso de Animales (National Academy Press, Washington DC, 1996). Se utilizaron 58 ratas machos de 3 meses de edad, 28 de la cepa Wistar Kyoto (WKY) con un peso de 300 g a 380 g y 30 espontáneamente hipertensas (SHR) de 280 g a 340 g. En un estudio piloto realizado para determinar la presión de perfusión necesaria para equiparar el caudal por gramo de tejido en los corazones de las SHR se usaron dos ratas de cada cepa. A todos los animales se les determinó la presión arterial sistólica por el método pletismográfico en la cola, el día previo al sacrificio. Las ratas fueron sacrificadas por dislocación cervical luego de ser sedadas con ketamina 60 mg/kg y acepromacina 0,1 mg/kg por vía intraperitoneal. Los corazones fueron extraídos rápidamente y colocados en solución de Krebs-Henseleit con heparina a 4°C. Desde la disección del tejido extracardíaco hasta ser conectados al sistema de perfusión transcurrieron menos de 3 minutos. Se perfundió a presión constante de 80 cm H₂0 o 130 cm H₂0 en el caso de las SHR, con una solución de Krebs-Henseleit modificada que contenía (en mM): 121 NaCl, 25 NaHCO₃, 1,2 Na₂HPO₄, 5 KCl, 2,5 CaCl₂, 1,2 MgSO₄, 11 glucosa, que al ser burbujeada con 5% CO₂ en O₂, tenía un pH de 7,4 ± 0,1 a 36,5 ± 0,5 °C. 

Luego de 20 minutos de estabilización del preparado se obtuvieron los registros de control durante 10 minutos. A continuación los corazones fueron sometidos a 15 min de isquemia regional por ligadura de la arteria coronaria descendente anterior realizada con un hilo de seda 6-0 cuyos extremos fueron introducidos en un tubo de polietileno, para poder ocluir el flujo en forma intermitente. Al finalizar los 15 minutos de isquemia se restableció la circulación coronaria durante otros 15 minutos. Las variaciones de caudal coronario se utilizaron para evaluar la eficiencia de la ligadura (descenso mayor a 25%) y de la reperfusión. Los preparados se dividieron al azar en dos grupos para cada cepa: WKY (n=13), WKY-PCI (n=13), SHR (n=15) y SHR-PCI (n=13). El PCI consistió en tres ciclos de 30 s de reperfusión y 30 s de isquemia regional practicados inmediatamente después de los 15 min de isquemia. Al final del período de reperfusión se volvió a ocluir la arteria y se perfundió azul de Evans a fin de delimitar el área sometida a isquemia. El grado de hipertrofia miocárdica se evaluó en base al peso cardíaco relativo (PCR en mg/g) obtenido dividiendo el peso del corazón en miligramos por el peso de la rata en gramos. Para determinar el área isquémica se cortaron los ventrículos en rodajas de 2 mm desde el ápex a la base, las cuales fueron fotografiadas y evaluadas por planimetría utilizando el programa ImageJ. 

Se excluyeron los corazones con áreas menores a 40% de la masa ventricular, ya que este nivel de isquemia es el mínimo requerido para garantizar homogeneidad y reproducibilidad en la incidencia de arritmias de reperfusión ⁽¹³⁾. 

ANáLISIS DE LAS ARRITMIAS 

Se registró el electrograma de superficie en corazones latiendo espontáneamente por medio de electrodos extracelulares ubicados uno en la aurícula derecha y el otro en la punta del corazón, conectados a un electrocardiógrafo Hewlett-Packard 1500A. La señal analógica fue digitalizada y almacenada para un análisis posterior usando una placa conversora NI PCI-6221 (National Instruments) y el programa LabView Express 2.5. Se clasificaron las arritmias ventriculares de acuerdo a la convención de Lambeth ⁽¹⁴⁾. Se evaluaron la incidencia y las duraciones de la taquicardia ventricular (TV) y de la fibrilación ventricular (FV). El análisis de la severidad de las arritmias se realizó por medio de un escala de severidad modificada de Curtis y Walker que evalúa el ritmo más severo encontrado minuto a minuto, usando 5 puntos: 0-Ritmo sinusal; 1-Latidos ventriculares prematuros o bigeminia; 2-Salvas, 3-TV no sostenida (<30 s); 4-TV sostenida (>30 s) o FV ⁽¹⁵⁾. 

ANáLISIS ESTADíSTICO 

Los resultados fueron expresados como media ± error estándar de la media o como mediana y rango intercuartílico, según se distribuyeran normalmente o no. Se utilizó ANOVA a una vía con postest de Bonferroni o test de Kruskal-Wallis con postest de Dunn. La comparación de frecuencias se realizó mediante el test C². Se consideró significativo un valor de p<0,05. 

RESULTADOS 

La presión arterial sistólica en la cepa WKY fue de 128 ± 5,9 mmHg, con un PCR de 4,2 ± 0,5 mg/g. En los animales de la cepa SHR la presión fue de 170 ± 3,7 mmHg y el PCR de 5,9 ± 0,7 mg/g, ambos significativamente diferentes (p<0,001) con respecto a la cepa WKY, sin que se evidenciaran diferencias entre los que fueron poscondicionados y los que no. 

 Figura 1. Caudal coronario por gramo de tejido miocárdico en diferentes períodos del protocolo experimental. PI corresponde al último minuto antes
de realizar la isquemia, ISQ es el caudal del último minuto previo a la reperfusión y REP indica el inicio de la reperfusión, incluye los caudales 
de la maniobra de PCI. Los números corresponden a los minutos en que se realizaron mediciones de caudal durante la reperfusión. # p<0,05 vs PI para cada grupo.

Se eliminaron del análisis final dos corazones pertenecientes al grupo SHR porque la oclusión no alcanzó a generar un 40% de área isquémica. 

Como se aprecia en la figura 2A, en todos los grupos se observaron taquiarritmias sostenidas o FV durante el primer minuto de reperfusión, mientras que los grupos sometidos a PCI recuperaron el ritmo sinusal al finalizar el ciclo. Los trazados electrocardiográficos del primer minuto corresponden a FV, mientras que en los del tercer minuto los grupos PCI muestran un predominio del ritmo sinusal. 

El panel 2B grafica la cuantificación de los casos de TV sostenida o FV, o ambas, donde se aprecia que todos los grupos desarrollaron severas arritmias de reperfusión en el primer minuto. Al tercer minuto, en los corazones sometidos a isquemia/reperfusión, todavía predominaba la presencia de severas arritmias, las que se mantuvieron durante toda la reperfusión. La maniobra de PCI provocó que la mayoría de los corazones, tanto de las WKY como los de las SHR retomaran el ritmo sinusal, sin embargo, persistieron algunos episodios de arritmias transitorios, sobre todo en las SHR, como puede apreciarse en el trazado electrocardiográfico de la figura 2A. 

El efecto de restitución del ritmo sinusal fue respaldado por la reducción de la puntuación de la escala de severidad luego de la maniobra de PCI, y además indica que el efecto no fue transitorio, ya que en los corazones no poscondicionados se mantuvo un alto nivel de severidad (figura 3). 

Figura 3. Puntuación en la escala de severidad de las arritmias minuto a minuto para cada grupo desde el décimo minuto de la isquemia 
hasta el décimo de la reperfusión.  * p<0,05 vs WKY y + p<0,05; + + p<0,01; +++ p<0,001 vs SHR.

Como se puede apreciar en la tabla 1, el mayor efecto antiarrítmico se produjo principalmente en base a una reducción de la duración de la fibrilación ventricular, ya que la duración de la taquicardia no presentó diferencias significativas. 

]]>

Al analizar la frecuencia cardíaca, en la tabla 2 se muestra que no se evidenciaron cambios durante la preisquemia ni durante la isquemia para los diferentes grupos en estudio. En la reperfusión se apreció una marcada bradicardia transitoria en los corazones a los que se les aplicó la maniobra de PCI, sin embargo solo se pudo comparar contra el control el primer minuto de la reperfusión, ya que el resto del tiempo las taquiarritmias impidieron tomar la frecuencia cardíaca en los grupos no poscondicionados. 

DISCUSIóN 

En este trabajo se demostró que el PCI, mediante tres ciclos de 30 s de reperfusión/30 s de isquemia regional, fue capaz de restituir a ritmo sinusal la mayoría de los corazones que presentaron arritmias ventriculares de reperfusión y que el efecto antiarrítmico también se manifestó en corazones hipertróficos provenientes de ratas SHR. 

El PCI logró revertir las severas arritmias de reperfusión, pero no prevenirlas, como se aprecia en la figura 3. La taquicardia y la FV se desencadenaron precozmente en todos los corazones, incluso antes del primer episodio de isquemia de la maniobra de PCI, pero sólo persistieron en los corazones no poscondicionados (figura 2A). Es probable que la precocidad de la aparición de la FV haya influido en la falta de reducción de la incidencia (figura 2B). En apoyo a esto último, otros autores han demostrado que si se produce la primera isquemia en forma temprana se puede disminuir la incidencia de FV y de arritmias sostenidas, pero no de otras formas menos severas de arritmias ^(6,16). El efecto protector se mantuvo luego de finalizada la maniobra de PCI, persistiendo solo algunos episodios arrítmicos autolimitados, lo que también se refleja en la tabla 1. Estos resultados nos orientan a pensar que el PCI otorgaría un efecto antifibrilatorio al impedir el mantenimiento de circuitos de reentrada, pero que no interferiría con la actividad gatillada propuesta para el desencadenamiento de las arritmias ⁽¹⁷⁾. En efecto, se ha publicado que el PCI es capaz de revertir la FV si el episodio isquémico se inicia luego del primer minuto de reperfusión y aún es efectivo si es instaurado hasta 15 minutos de iniciada la misma ^(18,19). 

Nuestros resultados respaldarían el efecto cardioprotector del PCI encontrado a nivel clínico y alentarían a esperar buenos resultados en la protección contra las arritmias de reperfusión. Si bien no se pueden trasladar los hallazgos obtenidos en modelos animales in vitro al escenario clínico, la primera descripción del efecto antiarrítmico del PCI se realizó en un paciente. Durante un procedimiento de angioplastia en un infarto agudo de miocardio se observó que breves reoclusiones con el balón permitieron revertir un episodio de ritmo idioventricular acelerado, causante de descompensación hemodinámica ⁽²⁰⁾                                                                                                                                                                       . Esto motivó que utilizáramos un modelo de isquemia regional para simular un síndrome coronario agudo y que usáramos un protocolo de poscondicionamiento con isquemia regional a fin de reproducir las condiciones de PCI con angioplastia, como se aprecia en los cambios del caudal coronario ( figura 1). Las taquiarritmias ventriculares sostenidas ocurren en aproximadamente 6% de los pacientes reperfundidos, siendo más frecuentes en aquellos que presentan áreas isquémicas de mayor tamaño ^(1,2). Por ello, establecimos como criterio de inclusión aquellos corazones con áreas isquémicas mayores al 40%, lo cual nos permitiría anticipar el efecto del PCI en pacientes con mayores probabilidades de sufrir arritmias. Asimismo, sugiere que los corazones hipertrofiados también se beneficiarían de una intervención cardioprotectora con propiedades antiarrítmicas. 

A pesar de que este estudio no fue diseñado para analizar los mecanismos antiarrítmicos del PCI, como se aprecia en la tabla 1, nos llamó la atención la marcada bradicardia transitoria durante la maniobra. La misma podría explicarse, según Lathrop y Spooner, por la participación de redes neurales intracardíacas capaces de regular la frecuencia en un modelo desconectado del resto del sistema autónomo ⁽²¹⁾. La generación de reflejos con propiedades cronotrópicas negativas durante las isquemias regionales transitorias de la maniobra de PCI podrían actuar sobre el nódulo sinusal ⁽²²⁾. En estudios previos de nuestro laboratorio hemos encontrado que la bradicardia marcada ejerce un efecto protector contra las arritmias de reperfusión ⁽¹⁷⁾; sin embargo, serán necesarios más estudios para dilucidar los mecanismos por los cuales el poscondicionamiento es antiarrítmico. 

Como se muestra en la figura 1, el PCI no mejoró significativamente la recuperación del caudal coronario durante la reperfusión, lo cual podría deberse a la falta de protección de esta maniobra contra el daño microvascular (fenómeno de no reflujo). Resultados similares fueron encontrados en otros modelos experimentales de isquemia/reperfusión ^(23,24). 

A pesar de ser un modelo animal, nuestros resultados permiten presuponer que cuando se realicen ensayos con un mayor número de pacientes tratados con PCI se confirmará la cardioprotección en corazones hipertróficos y se encontrará que posee un efecto antiarrítmico. 

Este trabajo fue financiado con subsidios de la UNCuyo, 06/J326 y 06/J320. Agradecemos a la Lic. Adriana Carrión por su invalorable apoyo técnico. 

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