El uso del trasplante de células miogénicas en medicina fue propuesto en 1978 por Partridge, Grounds y Sloper, quienes sugirieron que "en pacientes portadores de miopatías hereditarias recesivas, la función muscular podría ser restaurada si se lograra que mioblastos normales fusionaran con las fibras musculares patológicas"(6). Estos autores se referían al implante de mioblastos, las células mononucleadas precursoras del músculo esquelético.

Las propiedades potencialmente útiles del trasplante celular para el tratamiento de patologías del músculo esquelético son tres: inducir la síntesis de proteínas terapéuticas en las fibras musculares, regenerar tejido contráctil, y reponer la población de células madre.

1) Síntesis de proteínas terapéuticas. Al integrarse las células trasplantadas a las fibras musculares del receptor, la coexistencia de núcleos del donante y del receptor en un mismo sincicio determina que se sinteticen allí proteínas de ambos orígenes. Por este mecanismo, estas fibras musculares "híbridas" pueden producir la proteína cuyo déficit genético causaba una miopatía. En la distrofia muscular de Duchenne, miopatía degenerativa de origen genético ligada al cromosoma X, los pacientes sufren una pérdida muscular progresiva debida al déficit de distrofina, una proteína asociada a la membrana celular. Nuestro equipo demostró recientemente que mediante la inyección intramuscular de mioblastos de donantes normales, utilizando la técnica desarrollada por el autor, se obtenía sistemáticamente la síntesis de la distrofina del donante en fibras musculares de estos pacientes(7-9) (figura 1 C a H). Los niveles de corrección molecular en nuestros ensayos clínicos variaron de 3% a 34,5% del tejido muscular en los sitios inyectados con mioblastos normales. Estos porcentajes dependieron esencialmente de: (a) variables técnicas en la inyección de las células; (b) la calidad de las mismas, y (c) la presencia o no de rechazo inmunológico.

2) Generación de nuevo tejido contráctil. La capacidad de los mioblastos de ratón para reconstituir el tejido muscular fue observada en casos de destrucción muscular aguda, severa e irreversible(10,11). En nuestra experiencia clínica hemos observado neoformación de fibras musculares, si bien pequeñas, en pacientes que recibieron inyecciones intramusculares de mioblastos normales(7). Esta propiedad se intenta explotar clínicamente para el tratamiento de la incontinencia urinaria por deficiencias del esfínter externo de la uretra(12). El principio de este tratamiento consiste en reforzar el esfínter mediante el autotrasplante de células miogénicas cultivadas a partir de una biopsia muscular realizada al propio paciente. Un ensayo clínico preliminar reportó mejoras de la incontinencia urinaria en cinco de ocho mujeres tratadas de este modo, una de las cuales logró continencia total(5).

3) Reposición de células madre. Estudios en ratones mostraron que los mioblastos trasplantados dan origen también a células satélite, las células madre específicas del músculo esquelético(13,14). Nuestra experiencia clínica también sugiere que la misma propiedad ocurriría en el humano(7).

El músculo esquelético es uno de los tejidos altamente diferenciados que poseen capacidad regenerativa. Ello es posible gracias a la existencia de progenitores específicos: las células satélites (figura 1 A y B). Las células satélites permanecen quiescentes en la periferia de las fibras musculares hasta que estas sufren un daño; en ese momento se activan y dividen generando mioblastos, los cuales proliferan y se fusionan para formar miotubos, elementos multinucleados alargados que aumentan de volumen hasta reconstituir las fibras musculares. Las células satélite son consideradas células madre, ya que se dividen en forma asimétrica(15,16), es decir, al dividirse generan elementos diferenciados al tiempo que mantienen el pool de células madre.

Dos tipos celulares de la médula ósea han sido rotulados como células madre: las células madre hematopoyéticas y un grupo de células estromales definidas como células madre mesenquimatosas. Si bien se reportó la diferenciación de células estromales en células musculares(17,18), la experiencia del autor en primates no humanos fue negativa(1). La observación en cuanto a que células circulantes derivadas de la médula ósea fusionaban ocasionalmente con fibras musculares despertó cierta expectativa en el uso potencial de esta técnica para el tratamiento de las distrofias musculares(19,20), pero luego se confirmó en ratones(21), perros(22) y pacientes(23) con distrofia muscular, que este fenómeno era irrelevante, observándose, respectivamente, apenas 0,25%, 0% y <1% de fibras musculares con corrección del defecto molecular. La especulación sobre que el mismo era debido a células madre circulantes fue puesto en jaque por experimentos que lo explicaban meramente por la fusión ocasional de monocitos o macrófagos en las fibras musculares en regeneración(24).

En los últimos años, un equipo italiano publicó resultados sorprendentes mediante el uso de una nueva célula a la cual se denominó mesoangioblasto(25,26). En ratones con distrofia muscular se corrigió el defecto molecular en más de 50% de las fibras musculares luego de inyecciones intraarteriales de mesoangioblastos de ratones normales(26). En perros con distrofia muscular, las inyecciones intraarteriales de mesoangioblastos normales corrigieron el defecto molecular en 4% a 70% de las fibras musculares, dependiendo del animal y del músculo analizado, reportándose además mejoras en la motricidad(25). Algunos autores, sin embargo, cuestionan la validez de la mejoría clínica de los animales, que podría deberse a la inmunosupresión(27), y quedan por determinar las potenciales consecuencias en otros órganos de una administración sistémica de grandes cantidades de células.

Si bien es el método más frecuente, su limitante es que las células inyectadas se integran esencialmente a las fibras musculares vecinas al sitio de inyección, fenómeno descripto por el autor en primates no humanos(28-30) y en pacientes(7,9). Ello impone una cantidad elevada de inyecciones para lograr una incorporación significativa de las células injertadas. Experimentalmente se ha intentado expandir la fusión de los mioblastos implantados mediante diversas técnicas. El uso intramuscular de sustancias miotóxicas es eficaz en roedores(31), pero no siempre reproducible en primates no humanos(28,30). Inhibir la proliferación de las células satélite del receptor mediante radiación ionizante favorece la participación de las células trasplantadas en ratones(31,32). Estrategias de terapia génica ex vivo, como la modificación genética de los mioblastos para inducir la secreción de enzimas que degradan la matriz extracelular(33), no han logrado, en nuestras manos, mejorar los injertos en primates no humanos(34). Dado que por el momento no se ha conseguido extender la integración de las células implantadas más allá de los sitios de inyección utilizando técnicas aplicables en la clínica con un adecuado margen riesgo/beneficio, el autor ha considerado necesario mejorar técnicamente el implante celular mediante el uso de dispositivos que aceleren, faciliten y sistematicen la inyección intramuscular repetitiva de células. Con esa finalidad, hemos adaptado dispositivos manuales existentes para otros fines (reparto fraccionado de pequeñas cantidades de líquido en laboratorio)(35) y, en una segunda etapa, desarrollado dispositivos con cierto grado de automatización, diseñados específicamente para el implante celular repetitivo(36). También hemos propuesto, como estrategia de futuro, el desarrollo de dispositivos de implante robotizados, programables según un análisis imagenológico de las regiones a inyectar(37,38).

Supervivencia a corto plazo

Dejando de lado el rechazo hiperagudo (habitualmente evitado por la detección de anticuerpos antidonante en el receptor), la supervivencia inmediata del trasplante celular puede verse perjudicada por fenómenos que no están presentes en el trasplante de órganos, como la anoikis(39), un mecanismo de apoptosis activado por la pérdida de contacto entre la célula y su sustrato. Por otro lado, si las células implantadas proliferan la mortalidad puede compensarse(40). Existe consenso en cuanto a que en el trasplante de precursores musculares un porcentaje apreciable de las células implantadas muere en los primeros tres días. En nuestras experiencias en ratones, esa muerte celular, evaluada con un marcador radioactivo, varió de 70% en el trasplante de células de cultivos primarios a 97% en el trasplante de células clonadas y modificadas genéticamente(40). El autor fue el primero en mostrar evidencias de apoptosis y necrosis en las células injertadas en el período inmediato postrasplante(40) (figura 2). Este fenómeno no compromete el injerto debido a que no todas las células mueren y a que la proliferación compensaría la mortalidad en forma parcial(41) o total(40).

Este proceso de muerte precoz no está aún bien caracterizado y existen controversias sobre sus causas. Algunas observaciones en ratones llevaron a que nuestro grupo postulara como causa la reacción inflamatoria(42), aunque un estudio posterior parecería refutar esta hipótesis(43), sugiriéndose incluso que los macrófagos podrían tener un efecto protector en los mioblastos trasplantados(44). Recientemente, el autor demostró la importancia de la isquemia en las acumulaciones intratisulares que forman células implantadas(45). Sólo una faja periférica de 100 a 200 µm se beneficia de la difusión de oxígeno y nutrientes a partir del tejido receptor, mientras que las células situadas en el centro mueren (figura 3). Este fenómeno limita el número de células que pueden implantarse por inyección directa en un único sitio: los implantes de 1 x 106, 3 x 106, 10 x 106 y 20 x 106 de células presentaron, respectivamente una media de 2%, 9%, 41% y 59% de necrosis isquémica(45).

Supervivencia a largo plazo

El único factor que parece comprometer la supervivencia a largo plazo del injerto celular es el rechazo agudo, presente en condiciones alogénicas. El rechazo agudo de las fibras musculares híbridas en condiciones de inmunosupresión inadecuada fue descripto por el autor en primates no humanos(28,29) y en pacientes que recibieron alotrasplantes de mioblastos(7) (figura 4). Los medios actuales o potenciales para evitar el rechazo agudo son la inmunosupresión, el desarrollo de tolerancia inmunológica, y el autotrasplante.

Inmunosupresión. La elección de protocolos de inmunosupresión debe ser cuidadosa, pues algunos fármacos pueden tener efectos nocivos sobre las células implantadas. Un ejemplo es la ciclofosfamida, usada en un ensayo clínico preliminar de trasplante de mioblastos(46), la cual eliminaría las células trasplantadas en la medida en que estas proliferen(47). La ciclosporina, si bien fue usada en ratones(10,48), posee propiedades que pueden afectar el éxito del injerto: inhibe la fusión de mioblastos in vitro(49), interfiere con su diferenciación(50) y puede inducir su apoptosis(50). El micofenolato mofetilo inhibe la fusión in vitro de los mioblastos de ratón(51), aunque no parece afectar el resultado del injerto en macacos(29). Los mejores aloinjertos de mioblastos en el ratón fueron obtenidos por nuestro grupo usando tacrolimus(31). Esto llevó a que lo probáramos con éxito en macacos(28-30) y que se convirtiera en nuestro inmunosupresor de elección para ensayos clínicos(7-9).

Tolerancia inmunológica. Eludir el rechazo preservando la inmunidad contra patógenos y tumores, así como evitar los efectos adversos de los inmunosupresores, es un objetivo primordial de la investigación en trasplantes. Aunque el trasplante de células miogénicas presentaría problemas específicos para el desarrollo de tolerancia inmunológica periférica o central(52), podría ofrecer otras soluciones si fuera posible manipular las células ex vivo para reducir su inmunogenicidad(53). Un estudio en el cual se modificaron genéticamente mioblastos para que expresaran HLA-G (molécula que interviene en la tolerancia materna hacia el feto) mostró que estos eran capaces de resistir a la lisis por linfocitos activados(54).

Autotrasplante. Una forma de evitar la histoincompatibilidad es el uso de células del propio paciente, manipuladas in vitro para corregir el defecto genético. El principio fue probado en ratones por nuestro equipo y otros, trasplantando mioblastos de ratones o pacientes con distrofia muscular, previamente corregidos ex vivo(55,56). También hemos demostrado la viabilidad de la estrategia en macacos(57), importante para la extrapolación al hombre. Esta táctica, sin embargo, deja la posibilidad de un rechazo a largo plazo por incompatibilidad de antígenos menores (el producto del transgen incorporado en las células)(58).

Figura 2

Un riesgo potencial del trasplante de células con capacidad proliferativa es la formación de neoplasmas. Este riesgo es mayor en el caso de cultivos que puedan dar origen a líneas celulares continuas o en células donde una manipulación genética pueda activar oncogenes. En el ratón, por ejemplo, se observaron rabdomiosarcomas tras el trasplante de líneas continuas de células miogénicas(10,59). Si bien no se ha reportado formación de tumores tras el trasplante de mioblastos obtenidos de cultivos primarios, nuestro equipo considera prudente excluir la tumorigenicidad de las células a trasplantar en pacientes, observando su comportamiento in vivo. Las células son trasplantadas en músculos de ratones inmunodeficientes(60), evaluándose por histopatología si hubo formación de tumores (figura 5).

Los principales aspectos del trasplante de células miogénicas ya han sido analizados, por lo que se abordarán a continuación cuestiones específicas al músculo cardíaco.

La primera célula a considerar en medicina regenerativa es aquella que forma el tejido que desea reconstruirse. Si fuera posible extraer una biopsia de miocardio del propio paciente y proliferar sus cardiomiocitos en cultivo produciendo un número adecuado para el trasplante, la ingeniería tisular del miocardio se vería facilitada. Pero los cardiomiocitos del adulto no proliferan in vitro(66) y sólo la creación de ratones transgénicos en los cuales estas células proliferaban gracias a la expresión del antígeno T del papovirus SV-40(67), permitió estudios pioneros de trasplante de cardiomiocitos(68). Los cardiomiocitos fetales, por su lado, sí proliferan in vitro, y trasplantados en el corazón de ratones y perros son capaces de formar discos intercalares con los cardiomiocitos del receptor(69), integrándose funcionalmente al miocardio(70). En ratas, el trasplante de cardiomiocitos fetales en zonas de infarto fue capaz de neoformar tejido cardíaco, limitar la expansión de la cicatriz y mejorar la función cardíaca(71). Este implante evitaba la remodelación cardíaca pero no la revertía(72).

La facilidad para obtener y producir estas células, la posibilidad del trasplante autólogo, y el precedente de seguridad sentado por los trasplantes clínicos en distrofias musculares facilitaron su uso experimental en el corazón.

Estudios preclínicos. La técnica fue propuesta en 1989 por Kao y colaboradores(73). En sus primeros estudios, este equipo interpretó que los mioblastos injertados se transdiferenciaban en cardiomiocitos(73,74), lo que fue refutado luego por estudios más rigurosos(75). De hecho, las descripciones de "transdiferenciación" pueden explicarse por artefactos técnicos o por la fusión de mioblastos con cardiomiocitos del receptor(76). Taylor y colaboradores fueron los primeros en reportar una mejora de la función cardíaca tras el trasplante de mioblastos en una región necrótica del miocardio(77). Esta mejora no era producida por la neoformación de un tejido capaz de integrarse funcionalmente al miocardio, pues ambos quedaban aislados por la cicatriz. La ausencia de interacción electro-mecánica entre el tejido neoformado y el miocardio fue confirmada luego por registros intracelulares(78). Como corolario de varios estudios(79-83), se concluyó que el trasplante de mioblastos en el infarto era capaz de mejorar parcialmente la función miocárdica en modelos animales (sobre todo en roedores), aunque no por neoformación de un tejido capaz de contribuir a la contracción cardíaca, sino por cambios en las propiedades físicas de la cicatriz.

Ensayos clínicos de fase I. En el año 2000, el equipo del Dr. Philippe Menaché realizó en Francia la primera inyección intracardíaca de mioblastos autólogos en un paciente con insuficiencia cardíaca severa causada por un infarto de miocardio(84), iniciando el primer ensayo clínico de fase I(85). El mismo incluyó pacientes con cicatriz no viable y con indicación de bypass coronario (la cirugía permitía el abordaje del corazón para las inyecciones de mioblastos). El estudio mostró la viabilidad y seguridad de la técnica –con la salvedad de la aparición de arritmias– reportándose mejoras sintomáticas y estabilización de la fracción de eyección. Otros ensayos clínicos se sucedieron con protocolos y resultados esencialmente similares(86-88). En algunos pacientes se obtuvieron muestras de miocardio (por deceso o por trasplante cardíaco), donde la histología mostró acumulaciones de miotubos en la cicatriz del infarto(88,89). Como estos ensayos eran concomitantes a una cirugía de bypass coronario, no pudo dilucidarse en qué medida el beneficio era atribuible sólo al bypass o incluía el injerto. Algunos ensayos intentaron la implantación por catéter(90-92). Todos los estudios confirmaron la viabilidad del procedimiento, pero sugirieron un aumento de arritmias ventriculares.

Ensayos clínicos de fase II. Para evaluar de forma más concluyente el trasplante intracardíaco de mioblastos, el equipo del Dr. Menasché organizó un estudio clínico de fase II, multicéntrico, randomizado, en doble ciego, con control placebo y dosis escaladas(93). Noventa y siete pacientes fueron divididos en tercios que, durante un bypass coronario, recibieron respectivamente inyecciones de placebo, 400 x 106 mioblastos o 800 x 106 mioblastos. El implante no mejoró la función regional o global del ventrículo izquierdo por sobre el efecto del bypass, pero se consideró prometedor que la mayor dosis de células produjera una reversión significativa de la remodelación ventricular. Esta observación fue explicada por un potencial efecto de los mioblastos en la composición de la matriz extracelular de la cicatriz del infarto, que reduciría la fibrosis. Si ese efecto benéfico sobre la remodelación fuese persistente, podría traducirse en un mejor pronóstico para los pacientes. Con respecto a la seguridad del procedimiento, la proporción de pacientes que sufrieron arritmias no fue significativamente diferente entre los tres grupos, pero hubo más episodios de arritmia en aquellos que recibieron implantes de mioblastos. El riesgo de un aumento en la incidencia de arritmias, de hecho, parecería existir en otros tipos de trasplante celular en el corazón (aunque con menos frecuencia que con los mioblastos), y las células implantadas lo producirían por cualquiera de los tres mecanismos arritmogénicos mayores: reentrada, automatismo y actividad gatillada(94).

Se han detectado escasas células madre en el miocardio de ratones(95-97) y se describieron cardioblastos en el miocardio posnatal de ratones, ratas y humanos(98). Los mesoangioblastos también estarían presentes en el miocardio y podrían diferenciarse en cardiomiocitos(99). Ciertas evidencias sugieren además la presencia de células circulantes capaces de diferenciarse en miocardio. Las observaciones en roedores(63) parecen confirmarse en el hombre tras el análisis del tejido cardíaco de necropsias realizadas en varones que habían recibido un trasplante de corazón de mujer(64). La detección del cromosoma Y permitió inferir que 0,04% de los cardiomiocitos provenían del receptor y que esto ocurría en zonas de lesión. El uso de tales progenitores en medicina regenerativa dependería de la capacidad para aislarlos y proliferarlos en cantidad suficiente para el injerto, sin perder sus propiedades biológicas. Sin embargo, se debe destacar su ineficiencia para regenerar el miocardio en forma espontánea.

Estudios preliminares en roedores recurrieron al implante intramiocárdico de células madre embrionarias a fin de observar si ello bastaba para inducir su diferenciación en cardiomiocitos(100, 101). Los resultados fueron negativos y el implante generó teratomas, descartando el implante de células madre embrionarias indiferenciadas. Como la opción más lógica sería diferenciar las células madre embrionarias in vitro previo al trasplante, las condiciones de cultivo para ello comienzan a estar más definidas(102). Experiencias en ratones inmunodeficientes mostraron la capacidad de los cardiomiocitos derivados de células madre embrionarias humanas para regenerar el miocardio y mejorar la función cardíaca en zonas de infarto(103), aunque esa mejora no se mantenía a largo plazo(104). Aun dejando de lado los obstáculos ético-religiosos, ciertos detalles técnicos deben ser resueltos antes de una utilización clínica de cardiomiocitos derivados de células madre embrionarias; esencialmente, una separación específica, segura y con alto rendimiento. Por lo demás, fuera de un contexto de clonación terapéutica, su uso implica condiciones alogénicas y el recurso a inmunosupresión. Algunos autores pretenden que las células madre embrionarias tendrían privilegio inmunológico, es decir, serían "invisibles" al sistema inmunitario en un contexto alogénico e incluso xenogénico(105,106). Esta hipótesis, sin embargo, deja de lado el hecho de que estas células deben diferenciarse y de que las propiedades antigénicas de los cardiomiocitos obtenidos de células madre embrionarias no parecen diferir de sus homólogos adultos(107). Una vía interesante para la obtención autóloga de células pluripotentes con propiedades similares a las células madre embrionarias, eludiendo las controversias éticas, sería la reprogramación in vitro de células somáticas como los fibroblastos(108,109), posibilidad que está cobrando actualmente mucho interés(110). Se ha dado a estas células la denominación de células pluripotentes inducidas.

Aunque ciertos estudios sugieren que las células madre mesenquimatosas podrían diferenciarse en cardiomiocitos(111), su inyección intracardíaca podría comportar riesgos de formación ectópica de otros tejidos mesodérmicos. El implante intracardíaco de médula ósea en ratas, por ejemplo, produjo tejido óseo, atribuible al potencial osteogénico de las células madre mesenquimatosas(112). Un equipo interpretó que las células madre hematopoyéticas eran capaces de neoformar miocardio en la cicatriz de infarto en ratones(113), pero estudios posteriores en ratones(114), ovinos(115) y primates no humanos(116), fueron negativos, y se comprobó que las células madre hematopoyéticas inyectadas en el corazón se diferencian sólo en células sanguíneas(117).

Siendo el trasplante de médula ósea una técnica estándar en hematología, el paso de los experimentos en animales a ensayos clínicos fue rápido, usándose en forma autóloga tanto médula ósea no fraccionada como poblaciones seleccionadas (CD34+ y CD133+), administradas por vía intracoronaria e intramiocárdica(118). Si bien algunos estudios reportaron mejoras leves de la función cardíaca, pocos fueron randomizados y controlados y los resultados son contradictorios. Por otro lado, la inyección de células CD133+ por vía intracoronaria podría causar efectos adversos en las arterias coronarias(119,120).

Causas de la mejora postrasplante (figura 6)

El propósito original del trasplante celular intracardíaco era la regeneración de un tejido contráctil capaz de interactuar electro-mecánicamente con el tejido cardíaco del receptor. Pese a ciertos datos al inicio contradictorios, es evidente que los trasplantes de mioblastos y de células de la médula ósea no alcanzaron ese objetivo. Las mejoras de la función cardíaca observadas en los modelos animales y en los ensayos clínicos deben explicarse por otros mecanismos. La hipótesis predominante es que los injertos celulares limitan la remodelación del ventrículo izquierdo. Se ha propuesto que las acumulaciones de células trasplantadas engrosarían la pared del infarto y limitarían la dilatación del ventrículo(121). También se ha sugerido un efecto parácrino del implante, por el cual la matriz extracelular ganaría en propiedades elásticas(122). Más allá de dilucidar los mecanismos de los beneficios reportados, lo cierto es que estos últimos han sido muy limitados y el objetivo principal de la medicina regenerativa en este campo sigue siendo el señalado al inicio del párrafo.

La greffe de cellules à capacité myogénique est une stratégie expérimentale de médecine régénérative. Considérée au début comme un outil thérapeutique dans le traitement des myopathies, son usage au traitement potentiel de l’infarctus du myocarde est plus large de nos jours. Ce rapport, basé sur la bibliographie et l’expérience de l’auteur récoltée pendant plus d’une décennie consacrée à la recherche clinique et préclinique, prétend faire une brève mise à la page d’un sujet qui est censé avoir une grande incidence sur la médecine de ce siècle.