Retardo mental, malformaciones congénitas y aberraciones cromosómicas subteloméricas crípticas
Dr. Máximo E. Drets*, Br. Federico F. Santiñaque†
Servicio Nacional de Clasificación Celular y Citometría de Flujo.
Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable
Resumen
Los recientes progresos tecnológicos ocurridos en citogenética molecular han permitido la detección de numerosas minúsculas aberraciones en la región cromosómica contigua al telómero o segmento subtelomérico, que han sido relacionadas con diversos cuadros de retardo mental, malformaciones congénitas y otros síndromes de interés médico. Investigaciones previas, llevadas a cabo mediante exploración microfotométrica y análisis gráfico computacional del subtelómero, revelaron diferentes patrones de distribución de las densidades de la cromatina y la existencia de intercambios sumamente pequeños entre cromátidas hermanas en dicho segmento cromosómico. La detección de aberraciones crípticas sindromáticas, el elevado número de intercambios cromosómicos y las observaciones microscópicas sobre la estructura subtelomérica sugieren que reflejan la gran actividad genómica y la complejidad estructural prevalente en la región. En la presente revisión se describen brevemente varios síndromes cromosómicos subteloméricos, así como la estructura molecular y citológica de la región subtelomérica y las principales funciones del segmento cromosómico terminal a fin de brindar un panorama general sobre esta área de investigaciones en rápido crecimiento de considerable significación biomédica.
Palabras clave: RETARDO MENTAL Y MALFORMACIONES CONGÉNITAS.
ABERRACIONES CROMOSÓMICAS CRÍPTICAS.
† Becario del Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA), IIBCE, Unidad Asociada de la Facultad de Ciencias.
Correspondencia: Dr. Máximo E. Drets
Av. Italia 3318, CP 11600, Montevideo, Uruguay.
E-mail: drets@chasque.apc.org
Recibido: 2/12/04.
Aceptado: 28/1/05.
Introducción
La región subtelomérica es un peculiar segmento multifuncional localizado contiguo a la región terminal del cromosoma o telómero, el cual está formado por ácido desoxirribonucleico (ADN) repetido y componentes proteicos específicos que recubren al extremo cromosómico y mantienen constante su integridad estructural y funcional.
]]> El reciente hallazgo en esta región de un considerable número de aberraciones cromosómicas relacionadas con síndromes de retardo mental y malformaciones congénitas ha incrementado extraordinariamente los estudios destinados al esclarecimiento de su estructura y función en el genoma humano, habiéndose tornado en un explosivo campo de investigaciones y publicaciones por sus múltiples potenciales aplicaciones en patología y otros problemas biológicos generales.El objetivo de la presente revisión es brindar una introducción general acerca de esta nueva área, de tan extensa proyección clínica, haciendo especial referencia a los recientes avances acaecidos tanto a nivel microscópico como molecular sobre el telómero y su región contigua, el subtelómero, que puedan resultar de interés para el médico y el biólogo. Se abordan, por tanto, en forma resumida un número de tópicos relacionados con la estructura y función de dichos segmentos cromosómicos con el propósito de suministrar una visión actualizada sobre los papeles que desempeñan durante los procesos de replicación celular en el cáncer, en el envejecimiento celular y en la producción de síndromes de retardo mental y malformaciones congénitas últimamente descubiertos.
Retardo mental, malformaciones congénitas y aberraciones cromosómicas
El capítulo de la asociación sindromática de retardo mental y malformación congénita comenzó a dilucidarse citogenéticamente cuando Lejeune y colaboradores(1) descubrieron la trisomía 21, y Sutherland(2) halló que la fragilidad del cromosoma sexual X se podía detectar mediante cultivo celular en medios de cultivo carentes de ácido fólico.
Estas aberraciones cromosómicas determinantes de los síndromes de Down y de Martin-Bell, respectivamente, son las causas más frecuentes de retardo mental y malformación congénita. Sin embargo, un importante número de portadores de retardo mental y malformaciones congénitas continuaron siendo cuadros de origen inexplicable, por lo que fueron catalogados como "idiopáticos". Sólo recientemente ha sido posible establecer su origen citogenético debido a los perfeccionamientos citológicos y moleculares que posibilitaron la detección de aberraciones mínimas producidas en la región subtelomérica no advertidas previamente por los métodos citológicos convencionales, por lo que que han sido denominadas "crípticas", siendo responsables de por lo menos 7,5% de los casos de retardo mental idiopático(3). Se sostiene que las duplicaciones o delecciones producidas en el ADN de esa región cromosómica menores de 5Mb causan retardo mental sindrómico(4) lo que señala que aun muy pequeñas anomalías génicas son capaces de originar graves perturbaciones, en particular casos inexplicables de retardo mental(5).
La tabla 1 presenta una lista parcial sobre los variados tipos de aberraciones cromosómicas detectadas en los últimos años en la región subtelomérica. Un examen detenido de la tabla evidencia el hecho de que no se ha logrado, hasta el presente, establecer algún cuadro clínico definido asociado a una aberración cromosómica específica, sino que se ha observado una compleja constelación de delecciones, duplicaciones, translocaciones e inversiones, inclusive mosaicos celulares(6,7) que afectan diversos pares cromosómicos pero que, cada una de ellas, son capaces de originar, en mayor o menor grado, retardo mental de variada intensidad y malformaciones congénitas. Sin duda, no deja de sorprender que existan tan diversas aberraciones(8) producidas en una pequeña región cromosómica como lo es el segmento subtelomérico, por lo que las complicadas fórmulas de aberraciones reseñadas someramente en la tabla 1, y muchas otras no citadas, representan un verdadero reto diagnóstico aun para un avezado citogenetista. Se aguarda plausiblemente que la reiterada aplicación de las nuevas técnicas citogenéticas permitirá descubrir muchos más micro-reordenamientos intersticiales aumentando de este modo la complejidad diagnóstica de esta nueva área citológica(9).
En general los criterios que se emplean para indicar un estudio citogenético de la región subtelomérica se basan en: a) historia clínica con dos o más individuos afectados de retardo mental; b) retardo del desarrollo prenatal; c) anomalías del crecimiento posnatal; d) dismorfia facial; e) anomalías congénitas sin dismorfia facial; y f) cariotipo normal con bandeo G. La clínica de las constituciones genéticas anormales originadas por aberraciones cromosómicas subteloméricas que se han relacionado con los síndromes de retardo mental y malformación se ha tornado tan extensa y compleja que cualquier intento de describirla en forma detallada escapa completamente a los propósitos de esta breve revisión, por lo que se sugiere al lector consultar referencias que comprendan estudios amplios sobre el problema(10-15).
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Debido a la creciente importancia médica de esta región cromosómica resulta de interés, por tanto, describir las características citológicas y la constitución molecular de la región subtelomérica y sus vínculos con su segmento cromosómico contiguo, el telómero, de modo de proporcionar al clínico interesado los fundamentos generales que le permitan comprender más detalladamente los procesos citogenéticos que allí ocurren y que se relacionan con la patología congénita mencionada.
Estructura general del cromosoma eucariótico
Los cromosomas son los vehículos del material hereditario y, salvo algunas excepciones, sólo se pueden observar mediante el microscopio óptico o el electrónico cuando la célula se está dividiendo, estadio en el cual los cromosomas alcanzan su grado máximo de compactación.
Un cromosoma metafásico típico (figura 1) está constituido por dos cromátidas hermanas, las cuales permanecen unidas mediante proteínas de adhesividad principalmente a nivel del centrómero(42). Este dominio estructural es fundamental en la producción de la correcta segregación cromosómica y, por tanto, de la información genética a las células hijas. Cada cromátida posee en su extremo una compleja región denominada telómero, la cual permite la existencia y el mantenimiento de los cromosomas lineales a lo largo de la evolución de los seres vivos(43).
Bandas cromosómicas y su importancia en la práctica médica
]]> El cromosoma eucariótico se caracteriza por presentar estructuras transversales denominadas bandas cromosómicas. Las bandas se revelan mediante el empleo de varios métodos y técnicas de tinción. Según el patrón de bandas obtenido, las técnicas de bandeo cromosómico se clasifican en: a) técnicas de bandeo diferencial (bandeo G, Q y R) y, b) técnicas de bandeo selectivo (bandeo T y C)(44). En la tabla 2 se resumen las características más importantes de los principales patrones de bandeo.
Las bandas cromosómicas permiten la exacta identificación de cada par cromosómico, así como el diagnóstico de aneuploidías determinantes de síndromes congénitos. Se utilizan, además, como patrón de referencia para el mapeo de genes y oncogenes humanos, lo que resulta sumamente útil en la descripción citogenética de cuadros clínicos portadores de problemas hereditarios, habiéndose tornado asimismo en una herramienta esencial para el diagnóstico diferencial de un gran número de síndromes constitucionales(45).
Organización y compactación del ADN en el cromosoma metafásico
El ADN cromosómico está compuesto por secuencias nucleotídicas altamente repetidas, medianamente repetidas y de secuencia única, siendo estas últimas generalmente secuencias génicas codificantes o reguladoras. Las secuencias altamente repetidas se localizan en los cromosomas humanos principalmente en las regiones pericentroméricas heterocromáticas que se pueden observar al microscopio como bandas C(46).
Las secuencias medianamente repetidas pueden estar dispuestas en tándem, como es el caso de los minisatélites, microsatélites y del ADN telomérico, o dispersas a lo largo del cromosoma en forma de secuencias dispersas cortas (SINEs; "short interspersed elements") y de secuencias dispersas largas (LINEs; "long interspersed elements"). Tanto en los cromosomas del ratón, hámster chino, como humanos, las secuencias SINEs se encuentran concentradas en las bandas R, mientras que las secuencias LINEs se agrupan principalmente en las bandas G (tabla 2)(47-49) .
El cromosoma eucariótico es una estructura molecular altamente organizada, cuya molécula de ADN interactúa con una amplia gama de proteínas, en particular las histonas, las cuales constituyen una familia de proteínas básicas, altamente conservadas a lo largo de la evolución de las especies.
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Las histonas intervienen en la producción de un primer nivel de compactación de la cromatina mediante la formación de un octámero proteico denominado nucleosoma(50). La molécula de ADN realiza dos giros alrededor de cada uno de dichos octámeros, formando una estructura denominada fibra nucleosómica. A su vez, esta fibra alcanza un segundo nivel de compactación por la interacción de proteínas adicionales resultando en un enrollamiento helicoidal para formar la denominada fibra de 30 nm o estructura en solenoide(51). No se conoce completamente cómo se compactan después estas fibras para formar el cromosoma metafásico. Al respecto, se supone que la fibra de 30 nm forma bucles que están anclados a un "andamiaje" cromosómico, el cual determina la morfología característica del cromosoma metafásico. Dicho "andamiaje" es observable mediante microscopía electrónica en cromosomas en los que se han extraído las histonas, habiéndose hallado que está plegado en forma helicoidal en las regiones de las bandas G(52).
El telómero y la región subtelomérica. Componentes estructurales y funcionales
El término telómero (del griego telos, extremo y mero, partícula) fue acuñado por Hans Muller (Premio Nobel, 1946) para designar la porción terminal del cromosoma en 1940(53). Muller advirtió, durante sus investigaciones sobre la frecuencia y tipos de reordenamientos cromosómicos producidos por los rayos X, que la producción de aberraciones terminales era muy rara, por lo que dedujo que esa área debía poseer una función de protección para el cromosoma. Es admirable comprobar que en una época tan lejana, cuando ni se sospechaba que el ADN era la molécula clave que comandaba genéticamente a la célula, Muller haya tenido la exacta percepción de imaginar que debía existir, en los extremos cromosómicos, una estructura especializada destinada a preservar su integridad estructural. Los telómeros se descubrieron por primera vez, como entidades cromosómicas diferenciadas, en protozoarios ciliados tales como Tetrahymena y Oxytricha(54,55), sobre las cuales se han realizado numerosos estudios.
Estas regiones cromosómicas permiten a la célula distinguir entre cromosomas intactos y fracturados, y su pérdida origina cambios cromosómicos y celulares irreversibles que pueden originar neoplasias o muerte celular programada (apoptosis)(56,57). A su vez, esta región cromosómica está involucrada en los mecanismos de regulación de la expresión de genes adyacentes, en el inicio del apareamiento de cromosomas homólogos durante la meiosis, en el envejecimiento celular y en la carcinogénesis(58).
Los extremos cromosómicos poseen una composición y organización particular de la cromatina, lo cual posibilita su tinción selectiva mediante la técnica de bandeo T (figura 1), que revela el segmento donde se localizan los telómeros y la región subtelomérica. Esta técnica deriva del método citológico para producir bandeo R, ambos procedimientos desarrollados por Dutrillaux(59), y se basa en la incubación de las preparaciones cromosómicas durante un período determinado de tiempo, en un buffer fosfato-ácido cítrico a 87º C, seguido de tinción con Giemsa. Las bandas T son regiones muy resistentes a la desnaturalización por calor(60) con un una riqueza relativa en pares GC, y pueden ser, a su vez, muy ricas en secuencias Alu (SINEs). Con este simple método se tiñen, en forma diferencial, los segmentos terminales cromosómicos, los cuales abarcan la región subtelomérica por lo que no es, evidentemente, un método para revelar a los telómeros ya que, como lo señalaremos más adelante, son estructuras moleculares no visualizables con el microscopio óptico.
]]> Mediante microscopía electrónica el segmento subtelomérico aparece como una apretada madeja de filamentos(61), que refleja la compleja asociación subyacente del ADN con las proteínas características de la región, lo cual le confiere una elevada resistencia a la digestión por endonucleasas(62).Los progresos ocurridos en los últimos años sobre el conocimiento de estas regiones cromosómicas han determinado que el telómero se haya tornado en un concepto estrictamente molecular y que las observaciones microscópicas que se refieren a las complejas estructuras término-subterminales corresponden a un nivel organizacional superior, en el cual se observan las aberraciones cromosómicas que se relacionan con diversos cuadros patológicos en el ser humano.
ADN telomérico
En la mayoría de los organismos eucariotas los telómeros están constituidos por la repetición en tándem de una secuencia muy corta de ADN, generalmente rica en los nucleótidos guanina (G) y citosina (C)(63-65). En los cromosomas humanos la secuencia telomérica es TTAGGG(66) (figura 1), la cual está altamente conservada en los vertebrados(67) y abarca una extensión de unos 5 a 15 kb. Esta secuencia se ha encontrado también en regiones pericentroméricas de cromosomas de algunos mamíferos así como dispersa en sitios intersticiales del genoma(68).
El extremo físico del ADN telomérico culmina en una larga monohebra rica en G, generando un extremo 3’ saliente, el cual se ha observado en todos los extremos cromosómicos, lo que sugiere que debe existir un procesamiento nucleolítico de la hebra rica en C(69) . El extremo 3’ saliente del ADN telomérico está muy conservado en los mamíferos y otros eucariotas, y se cree que tiene relación con la formación y estabilización de una estructura telomérica especializada denominada bucle-t (t-loop).
El modelo del bucle-t supone que la región terminal de la molécula de ADN forma un gran bucle terminal, que incluye el extremo 3’ saliente en el ADN telomérico de doble cadena(70). Este modelo se basó en observaciones de microscopía electrónica de fibras cromatínicas teloméricas que aparecen in vitro como bucles terminales cerrados en forma de bucle-t, habiéndose aislado estos bucles en células humanas y de ratón, lo que sugiere que muy probablemente son estructuras presentes in vivo(71).
ADN subtelomérico
La región subtelomérica es extraordinariamente compleja y está formada por una mezcla de regiones de ADN de secuencia única con distintas familias de ADN medianamente repetido que se caracterizan por ser polimórficas(58).
]]> La región subtelomérica está organizada, en general, en dos áreas o subdominios, uno distal con respecto al centrómero (figura 1), caracterizado por la presencia de secuencias repetidas cortas que son comunes a varios cromosomas, y otro proximal con secuencias repetidas largas comunes a unos pocos cromosomas. Estos dos subdominios estarían separados entre sí por una región de repetidos teloméricos (TTAGGG)n(72). Como resultado del mapeo genómico y análisis inicial de las secuencias subteloméricas de casi todos los cromosomas humanos(73), se ha determinado que la región subtelomérica está enriquecida 25 veces en secuencias teloméricas, las cuales forman islas de (TTAGGG)n con un tamaño promedio de 151-200 pb, pudiendo estar agrupadas o dispersas, tanto en el ADN repetido como en el de secuencia única (figura 1). Debe destacarse que la región subtelomérica posee una concentración de genes más elevada que el resto del genoma donde, además, se encuentra el mayor número de oncogenes mapeados hasta el presente(72,73).Los segmentos subteloméricos son regiones extraordinariamente dinámicas, variables y de rápida evolución en el genoma humano(74) determinando que sea una fuente potencial de diversidad fenotípica pero, al mismo tiempo, representando un lugar de reordenamientos cromosómicos que puede derivar en enfermedades congénitas(75).
Proteínas teloméricas
Los telómeros son un complejo nucleoproteico que proporciona a los cromosomas un recubrimiento protector, asegurando su estabilidad y la correcta segregación de la información genética durante la división celular, manteniendo la estructura cariológica característica de cada especie (figura 2)(76). Dicho "recubrimiento telomérico" está asegurado por la compleja estructura formada por las proteínas y el ADN telomérico existente en el extremo cromosómico(77).
Se han hallado hasta el presente tres proteínas que son capaces de reconocer y unirse específicamente a las regiones de ADN telomérico, es decir, a las regiones de repetición en tándem de la secuencia TTAGGG. Estas proteínas son TRF1(78), TRF2 y POT1. Las primeras dos reconocen exclusivamente al ADN bifilar, mientras que POT1 sólo reconoce a la monohebra de ADN rica en G. A su vez, se han caracterizado varias proteínas que si bien no reconocen específicamente la secuencia telomérica, forman parte de los telómeros integrando grandes complejos proteicos con TRF1 o TRF2. La proteína TRF2 es una de las proteínas más importantes en la formación del bucle-t y, al igual que TRF1, interviene en la estabilización de dicha estructura(79,80).
Métodos de detección de aberraciones subteloméricas crípticas
Las aberraciones cromosómicas de tamaño menor a cinco megabases no son observables por las técnicas de bandeo convencionales, ya que ellas no alteran el patrón de bandas obtenido por lo que, en citogenética, se denominan "crípticas". A fin de poder detectar las aberraciones subteloméricas, se pueden emplear: 1) marcadores subteloméricos polimórficos que evidencian desviaciones de la herencia mendeliana de alelos de sitios cromosómicos polimórficos cercanos a los telómeros(81,82); 2) métodos citogenéticos moleculares, basados en: a) técnicas de hibridación genómica comparativa (CGH; Comparative Genomic Hybridization)(83) o, b) la técnica de hibridización in situ fluorescente (FISH; Fluorescence in situ hibridization)(84). La técnica CGH permite la comparación de una muestra de ADN de una persona afectada con la de un individuo normal. En este método ambas muestras son fragmentadas y marcadas con distintos fluorocromos, para posteriormente mezclarlas e hibridarlas a una metafase normal. El análisis de los perfiles de fluorescencia de cada fluorocromo puede evidenciar alteraciones tales como delecciones o amplificaciones génicas en cada cromosoma.
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El método FISH posibilita la localización precisa de cualquier secuencia de ADN en el cromosoma, ya que utiliza una monohebra de ADN específica de dicha región, denominada sonda, la cual se conjuga con uno o varios fluorocromos y reconoce e hibrida únicamente a la secuencia complementaria del ADN cromosómico previamente desnaturalizado(85). Esta técnica tiene la ventaja de que puede utilizarse tanto en cromosomas como en núcleos interfásicos(86). En los últimos años se han incrementado las investigaciones destinadas a obtener métodos diagnósticos cada vez más precisos y confiables, disponiéndose actualmente de sondas subteloméricas para segmentos muy próximos a los telómeros de casi todos los cromosomas(87), conjugadas con distintas combinaciones de fluorocromos, específicas para cada par cromosómico. Como se emplean sistemas computacionales apropiados, se logra una rápida detección de dichas aberraciones crípticas facilitando considerablemente el diagnóstico diferencial en clínica(88).
Telomerasa, envejecimiento celular y cáncer
El mantenimiento de la integridad y estabilidad de los extremos cromosómicos a través de las sucesivas replicaciones celulares está íntimamente vinculado a la longitud del ADN telomérico, la cual se establece durante el desarrollo del cigoto(89,90). Aunque parezca paradójico, esta estructura tan importante para la estabilidad cromosómica se degrada sucesivamente en cada ciclo de replicación del ADN. Esto es, en parte, debido a la incapacidad replicativa para completar el extremo terminal de la hebra de ADN retrasada y también por la acción de nucleasas, que intervienen en la generación de los extremos 3’ salientes(91,69). El acortamiento progresivo del ADN telomérico actúa como un verdadero reloj biológico(92), ya que el momento en que una célula envejece y muere depende del número de divisiones celulares previas. Este fenómeno, denominado "senescencia celular", explica por qué mueren las líneas celulares en cultivo después de cierto número de pasajes in vitro(93).
Dicho acortamiento telomérico es observado en la mayoría de las células somáticas del organismo adulto, pero no en la línea germinal o en las primeras etapas del desarrollo embrionario(94), debido a que en éstas el acortamiento es contrarrestado por la actividad de una enzima crítica, la telomerasa(95) (figura 3). La enzima telomerasa es una transcriptasa reversa específica del telómero que extiende el ADN repetido terminal (TTAGGG) proporcionando, prácticamente en forma universal, las bases moleculares para un ilimitado potencial de proliferación celular.
La telomerasa está constituida por una subunidad catalítica proteica y por una molécula de ARN, la cual posee la secuencia complementaria de los repetidos teloméricos (AAUCCC)(94). De esta forma, la telomerasa le adiciona al ADN terminal secuencias repetidas teloméricas, utilizando su propio ARN como molde. La actividad de la telomerasa está ausente en la mayoría de las células somáticas humanas, pero presente en varias líneas celulares inmortalizadas in vitro y en 90% de las células cancerosas, en las cuales se reactiva dicha enzima, por lo que se interrumpe en ellas la declinación del acortamiento telomérico(96,97). Si bien se cree que la activación de esta enzima no es responsable de la transformación celular maligna, ella permite la proliferación indefinida de las células neoplásicas(98). No obstante, se observa en casi todos los tumores que la longitud telomérica se mantiene finalmente en forma estable, lo que sugiere que los mecanismos de regulación existentes en la región limitan, en ciertos casos, el alargamiento telomérico indefinido producido por la telomerasa(76,99).
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Indicaciones sobre la complejidad citológica de la región subtelomérica
Las regiones subteloméricas se pueden analizar mediante un sistema de microscopio fotométrico asociado a un sistema de computadora gráfica. Aparte de detalles técnicos menores, el microfotómetro consta básicamente de una electroplatina para microscopio que se mueve por pasos discretos (0,25 µm) y una fotocélula de alta sensibilidad (fotomultiplicadora), funcionando ambos dispositivos bajo comando computacional. Un programa apropiado determina que la platina se desplace paso a paso realizando, en cada uno, medidas muy precisas de la luz transmitida por el objeto analizado. Los valores medidos de las diferentes densidades son almacenados en la computadora que se emplean, en tiempo diferido, para generar imágenes gráficas de las estructuras cromosómicas. Tanto los programas computacionales diseñados por nosotros para analizar las estructuras nucleares y cromosómicas, como las imágenes generadas, han sido presentados detalladamente en diversos trabajos previos(100). El resultado final es un valioso sistema de microscopía analítica ya que el investigador dispone de una imagen cuantitativa muy ampliada y detallada de estructuras cromosómicas o de otros componentes celulares.
La exploración microfotométrica de las regiones terminales de cromosomas teñidos con el procedimiento de bandeo T y el posterior análisis computacional de las imágenes gráficas generadas permite detectar que las áreas de mayor densidad teñidas con el Giemsa se distribuyen de manera diferencial en ambas cromátidas hermanas. Sucintamente, son: 1) de igual tamaño en las dos cromátidas, 2) mayor en una que en la otra, o 3) sólo detectables en una única cromátida. Ambas estructuras diferenciales no pudieron asignarse a ningún cromosoma en particular(101). La existencia de estas inesperadas estructuras fue confirmada posteriormente analizando cromosomas endorreduplicados ya que en ambos cromosomas el patrón de distribución fue exactamente igual(102) (figura 4).
Un análisis detenido de las imágenes gráficas microfotométricas muestra que, en ciertos casos, las densidades más elevadas de la cromatina se distribuyen de tal modo que aparentan intercambios de cromátidas hermanas muy pequeños ocurridos en la región subtelomérica, los cuales hemos denominado "t-SCEs" (de: intercambios de cromátidas hermanas teloméricos)(101). Como este método de análisis no implica la sustitución de bases del ADN con bromodeoxiuridina (BrdU), que es el método citológico empleado corrientemente para detectar los intercambios de cromátidas hermanas, nosotros postulamos que este era un fenómeno que representa distintos estadios funcionales de la región del cromosoma normal(103).
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Mediante microfotometría de exploración hemos establecido también que tanto las señales fluorescentes generadas por las sondas teloméricas como las regiones de mayor densidad de la cromatina teñidas por el método de bandeo T se localizan prácticamente en las mismas áreas en la región subtelomérica, lo que sugiere que ambos hechos están relacionados por lo menos a nivel del microscopio óptico(104). Otro singular hallazgo sobre la reactividad subtelomérica fue la induccción de pequeños orificios en dicha región tanto en cromosomas normales como aberrantes y en ambas cromátidas o en una sola, cuyas localizaciones evocan la de los diferentes patrones de densidades mencionados(105,106).
Un hecho semejante a la distribución diferencial de las densidades cromatínicas fue observado también por Bekaert y colaboradores(107) estudiando el tamaño del telómero en tercera dimensión mediante microscopía confocal y sondas fluorescentes teloméricas, comprobaron que la longitud telomérica no era igual en las dos cromátidas hermanas de cromosomas de linfocitos humanos y que esta variabilidad no podía relacionarse con algún par cromosómico específico, lo que concuerda con nuestras observaciones sobre la distribución de los patrones diferenciales de densidades.
Discusión y conclusiones
La citogenética humana ha realizado nuevamente un aporte clave al dilucidar la causa de múltiples cuadros de retardo mental y malformaciones congénitas asociadas, un antiguo enigma de la patología humana. Debido a estos importantes avances acaecidos en esta área, el clínico actual no sólo debe familiarizarse con este nuevo conjunto de síndromes para realizar un diagnóstico diferencial preciso, sino que también debe disponer de los fundamentos conceptuales subyacentes en estas alteraciones congénitas.
En esta sucinta revisión se presentan, por tanto, una descripción citogenética general de algunos tipos de aberraciones observadas en dichos síndromes así como aquellos aspectos estructurales y moleculares del telómero y la región subtelomérica que se relacionan con la producción de aberraciones cromosómicas que originan retardo mental y malformación congénita a fin de brindar al médico una visión general sobre el problema.
El descubrimiento de estas aberraciones crípticas ha sido posible por los recientes refinamientos y nuevos métodos citogenéticos de análisis cromosómico, en particular el diseño de sondas fluorescentes desarrolladas para la región subtelomérica. Hasta hace muy poco era inimaginable que la alteración de pequeñas porciones de los cromosomas se tornaría en áreas críticas en patología humana. La multiplicidad de hallazgos es ahora de tal magnitud que se sostiene que por lo menos 6% del retardo mental "idiopático" podría explicarse por los reordenamientos submicroscópicos que afectan la región subtelomérica(87).
El hecho de que la región subtelomérica sea el sitio de un elevado número de intercambios, un hecho comprobado durante la decodificación del genoma de todos los cromosomas humanos(108,109,73), permite comprender por qué se están detectando en forma creciente numerosas aberraciones "crípticas" capaces, aparentemente, de generar variabilidad fenotípica, síndromes de retardo mental y perturbaciones del desarrollo embrionario.
Resulta realmente sorprendente apreciar cómo tan pequeñas alteraciones cromosómicas, cuyo tamaño está casi en el límite de resolución del microscopio, sean capaces de originar complejos cuadros clínicos de retardo mental y malformación congénita. Probablemente dichas aberraciones provocan un considerable desequilibrio génico que perturba el desarrollo normal del embrión, lo que originaría dichos síndromes.
]]> En este sentido, Pettenati y colaboradores(110) hallaron que pueden ocurrir reordenamientos cromosómicos entre la región subtelomérica y telomérica en individuos clínicamente normales que portan anomalías cromosómicas equilibradas en las cuales uno de los puntos de fractura involucra una banda terminal. Como estas regiones intervienen durante el apareamiento cromosómico meiótico, dichas alteraciones perturbarían la formación de las configuraciones cromosómicas normales, lo que interferiría con la producción gamética originando abortos e individuos portadores de aberraciones cromosómicas.La figura 4 resume, en forma diagramática, los hechos principales registrados hasta la fecha sobre esta área. La comprobada complejidad de ambas estructuras es aún materia de controversia. Persisten así una serie de interrogantes sobre cómo está organizada la cromatina en el cromosoma metafásico y cómo funciona y está estructurado realmente el conjunto molecular. Debido a esto es anticipable que se incrementarán de manera considerable las investigaciones sobre este segmento del cromosoma, en particular a nivel molecular. Asimismo, a medida que se desarrollen nuevas sondas específicas conjugadas con fluorocromos de alta eficiencia cuántica, se logrará detectar un número mayor de síndromes subteloméricos de interés clínico. Además, es evidente que en un futuro próximo se asignarán a la región muchas otras funciones aún desconocidas, considerando la elevada concentración génica predominante en la región característica de las bandas R y T, por lo que se obtendrá una imagen más precisa sobre estas áreas cromosómicas.
Aunque la microscopía electrónica permite visualizar la complejidad estructural existente en el segmento subtelomérico y que el análisis microfotométrico muestra la existencia de variabilidad en la distribución de las densidades de la cromatina, todavía no se ha proporcionado una imagen global convincente sobre cómo están asociados el ADN y las proteínas en esa región que explique satisfactoriamente las estructuras observadas a nivel microscópico, las cuales parecen poseer cierta impenetrabilidad estructural.
Tanto los diferentes patrones de densidad detectados en la región subtelomérica por nosotros, como las distintas longitudes teloméricas halladas por Bekaert y colaboradores(107) son hechos no aguardables de un punto de vista citogenético estrictamente ortodoxo dado que las cromátidas hermanas normales no debieran exhibir diferencias estructurales debido a que cada una está formada por una única molécula de ADN y, en mitosis, éstas poseen exactamente la misma secuencia, ya que son el producto de la replicación semiconservativa de una única molécula lineal de ADN antecesora. Por tanto, nosotros adelantamos la hipótesis de que, probablemente, las estructuras que observamos en este segmento expresan diversos estados funcionales de la región subtelomérica, una interpretación que es coherente con las más recientes observaciones estructurales y funcionales halladas en el segmento(104). Asimismo, los pequeños intercambios que hemos detectado en las regiones subteloméricas de las cromátidas hermanas (t-SCEs) deben interpretarse también como expresiones de la activa funcionalidad del segmento. Al respecto, se ha señalado la existencia en el genoma humano de inestabilidades en las secuencias intersticiales teloméricas(111), por lo que nuestras observaciones microscópicas podrían representar imágenes de esas inestabilidades. Aunque esta idea resulta atractiva será necesario llevar a cabo extensas investigaciones sobre los cambios estructurales originados por la actividad de los diversos mecanismos que operan en esta región del cromosoma, un asunto que originará seguramente el descubrimiento de nuevos e inesperados hechos relacionados. Otro aspecto, no menos importante, será poder establecer un vínculo convincente entre los componentes moleculares y las macroestructuras detectadas a nivel microscópico. El logro de esta síntesis seguramente permitirá relacionar dichas estructuras con las diferentes funciones conocidas y otras ignoradas hasta ahora, desempeñadas por el segmento subtelomérico brindando una imagen integral de la región.
Aun cuando en la presente revisión nos hemos ocupado preferencialmente de las aberraciones crípticas subteloméricas que originan retardo mental y malformaciones congénitas en pacientes y en familias, debe señalarse que también se han encontrado aberraciones similares en otras áreas médicas, en particular en hemato-oncología(112,113), cancerología(114), psiquiatría(115,116), ginecología(117), sobre las cuales sólo citamos unas pocas referencias a título de ejemplos. Asimismo, se han comenzado a vincular diversas aberraciones crípticas con el oscuro síndrome de autismo(27,118-120), todo lo cual ha expandido considerablemente el interés biológico y diagnóstico existente sobre esta región cromosómica cuyos estudios están inaugurando una nueva espectacular especialidad en medicina.
Agradecimientos
Los autores desean expresar su sincero agradecimiento al Prof. Dr. Rodolfo Wettstein por la revisión y valiosas sugerencias realizadas sobre el manuscrito. Quedamos reconocidos al Dr. Gustavo A. Folle por su amable cooperación en la obtención de las imágenes digitales que aparecen en la figura 3. Financiado en parte por el Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA), Uruguay.
Summary
]]> Recent technological advances occurred in molecular cytogenetics have allowed to detect numerous minute aberrations in the chromosome region contiguous to the telomere or subtelomeric segment which has been related to various conditions of mental retardation and congenital malformations and to other clinical syndromes of medical interest. Previous research on the subtelomere carried out by means of scanning microphotometry and computer graphic analysis, revealed different patterns of the distribution of chromatin densities and the existence of minute exchanges between sister chromatids in this chromosomic segment. The detection of cryptic syndromatic aberrations, the high number of chromosome crossovers and the microscopical observations on the subtelomeric structure suggest that they reflect the great genomic activity and the structural complexity prevailing in the region. In the present review, several subtelomeric chromosome syndromes, the cytological and molecular structure of the subtelomeric region as well as the main functions of the chromosome terminal segment are briefly described in order to give a general panorama on this fast growing research area of considerable significance in bio-medicine.
Résumé
Les derniers progrès technologiques en cytogénétique moléculaire, ont permis de repérer de nombreuses et minuscules aberrations dans la région chromosomique du télomère ou segment subtélomérique liées au retard mental, des malformations congénitales et d’autres syndrômes d’intérèt médical. Des recherches antérieures, menées à bout au moyen d’exploration microphotométrique et d’analyse graphique par ordinateur du subtélomère, ont montré de différents paramètres de distribution des densités de la chromatine et l’existence de minuscules échanges entre chromatides soeurs dans ce segment chromosomique. La détection d’aberrations cryptiques syndromatiques, le grand nombre d’échanges chromoso-miques et les observations microscopiques de la structure subtélomérique suggèrent une grande activité génomique et la compléxité structurelle prévalente dans la région. On décrit ici brièvement plusieurs syndrômes chromoso-miques subtélomériques, ainsi que la structure moléculaire et cytologique de la région subtélomérique et les principales fonctions du segment chromosomique terminal, afin d’offrir un panorama général sur cette sujet de recherches qui s’accroit considérablement.
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