Serotipos, perfil plasmídico y antibiotipos de cepas de Shigella flexneri aisladas de niños menores de 5 años con diarrea sanguinolenta usuarios de los servicios de Salud Pública
Dres. María Inés Mota*, Gustavo Varela†, Br. María del Pilar Gadea‡, Dra. María Inés Caffer¶, Lic. Alfredo Sirok*, Dr. Felipe Schelotto§
Departamento de Bacteriología y Virología. Facultad de Medicina. Universidad de la República
Servicio de Enterobacterias. Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (INEI). Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud (ANLIS). Dr. Carlos G. Malbrán. Buenos Aires, Argentina
Resumen
Introducción: en niños menores de 5 años con diarrea sanguinolenta, Shigella flexneri es el agente bacteriano más frecuentemente recuperado en nuestro medio. La shigellosis es una de las enfermedades infecciosas en las cuales el tratamiento con antimicrobianos es efectivo. La elección empírica del antimicrobiano adecuado es problemática debido a la resistencia de Shigella a diversos antibióticos. Esta situación estimuló el interés en el desarrollo de vacunas para el control de esta enfermedad. Debido a que algunas vacunas están orientadas a promover la respuesta inmune serotipo específica, es importante establecer la distribución de los serotipos prevalentes en la población que interesa inmunizar. El objetivo de este estudio fue caracterizar 50 cepas de Shigella flexneri aisladas a partir de niños con diarrea sanguinolenta, recuperadas en cuatro encuestas etiológicas de gastroenteritis.
]]> Método: a cada una se le realizó: serotipificación, estudio del patrón de lipopolisacárido, perfil plasmídico y estudio de sensibilidad a diferentes antimicrobianos.Resultados: los serotipos prevalentes fueron 2a, 3c, 4, 6, y 1. Se identificaron diez antibiotipos diferentes. En los cultivos del serotipo 2a se hallaron tres patrones plasmídicos; el 5 fue el más frecuente, seguido por el 6 y el 7. El análisis de la evolución de los antibiotipos circulantes mostró una tendencia hacia la aparición de tipos con mayor espectro de resistencia.
Conclusiones: vista esta evolución, y de acuerdo a los resultados obtenidos, resulta de interés ensayar un inmunógeno que incluya los determinantes "O" específicos de los serotipos 2a, 1, 3c, 4, 6 y el de Shigella sonnei.
Palabras clave: SHIGELLA FLEXNERI - aislamiento e identificación.
DIARREA INFANTIL - microbiología.
SEROTIPIFICACIóN.
* Ayudante de clase. Departamento de Bacteriología y Virología y Residente de Laboratorio. Facultad de Medicina. Instituto de Higiene Arnoldo Berta. Universidad de la República. Montevideo, Uruguay.
† Profesor Agregado. Departamento de Bacteriología y Virología. Facultad de Medicina. Instituto de Higiene Arnoldo Berta. Universidad de la República. Montevideo, Uruguay.
¶ Jefa del Servicio de Enterobacterias. Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (INEI). Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud (ANLIS). Dr. Carlos G. Malbrán. Buenos Aires, Argentina.
§ Profesor Director. Departamento de Bacteriología y Virología. Facultad de Medicina. Instituto de Higiene Arnoldo Berta. Universidad de la República. Montevideo, Uruguay.
]]> ‡ Asistente del Departamento de Bacteriología y Virología. Facultad de Medicina, Universidad de la RepúblicaCorrespondencia: Dr. Gustavo Varela
Departamento de Bacteriología y Virología. Facultad de Medicina, Universidad de la República. Alfredo Navarro 3051. CP 11600.
E-mail: bacvir@hc.edu.uy
Recibido: 8/3/04.
Aceptado: 28/12/04.
Introducción
La enfermedad diarreica es una causa importante de morbimortalidad en niños de los países menos desarrollados. A nivel mundial esta enfermedad es responsable de casi 25% del total de muertes que ocurren por año en niños menores de 5 años(1). El número anual de episodios de infección por Shigella en países en vía de desarrollo se ha estimado en 163 millones, con un millón de defunciones. Se considera que 70% de los casos reportados y 60% de las muertes ocurren en niños menores de 5 años(2).
La shigellosis es una de las enfermedades infecciosas en las cuales el tratamiento con antimicrobianos es efectivo. El uso de antibióticos adecuados disminuye la severidad y duración de la enfermedad, reduce el período de excreción de los microorganismos y previene las complicaciones(3). Sin embargo, la elección empírica del antimicrobiano es problemática debido fundamentalmente a la resistencia de Shigella a diversos antibióticos.
]]> En general, el porcentaje de cepas resistentes a dos o más antimicrobianos es de 80%, y varía según las regiones analizadas(4-7). El aumento en la prevalencia de cepas de Shigella resistentes estimuló nuevamente el interés en el desarrollo y uso de vacunas efectivas para prevenir esta enfermedad(2).Debido a que algunas de las vacunas en desarrollo están orientadas a la estimulación de la respuesta inmune contra los determinantes antigénicos serotipo específicos del polisacárido "O" del lipopolisacárido (LPS)(8-10), es importante establecer la distribución de los serogrupos y los serotipos de Shigella prevalentes en la población a inmunizar(11,12).
En nuestro país, y para niños con edades comprendidas entre 1 y 4 años, la mortalidad por diarrea de presunta causa infecciosa se ubicó en el año 2001 en el cuarto lugar de frecuencia, con una tasa específica de 0,5 por 100.000 habitantes(13). En niños con diarrea sanguinolenta y usuarios de los servicios de Salud Pública, Shigella flexneri y S. sonnei son los agentes bacterianos más frecuentemente recuperados, seguidos por Campylobacter jejuni; Escherichia coli productor de toxinas tipo Shiga (STEC); Salmonella y Escherichia coli enteroinvasor (EIEC)(14).
El objetivo de este estudio fue caracterizar un conjunto de cepas de Shigella flexneri aisladas a partir de niños con diarrea sanguinolenta atendidos en centros de Salud Pública, para avanzar con más fundamento en el manejo terapéutico y en la prevención de estas infecciones.
Material y método
Cepas bacterianas
Se estudiaron 50 cepas de Shigella flexneri recuperadas en Montevideo entre 1989 y 2003 a partir de muestras de materias fecales de niños menores de 5 años con diarrea sanguinolenta. Las muestras procedían de cuatro encuestas etiológicas distintas de gastroenteritis infantiles, realizadas en 1989-1990; 1990-1994; 1999 y 2001-2003, respectivamente, con muestras tomadas en el Centro Hospitalario Pereira Rossell, principal centro pediátrico público del país. Las cepas se identificaron por pruebas bioquímicas estándar(15). El serogrupo se determinó por la técnica de aglutinación en lámina utilizando antisueros policlonales comerciales (Difco Laboratories. Detroit, USA). La serotipificación de las cepas se realizó con sueros absorbidos serotipo-específicos de la colección de nuestro laboratorio(15). Para validar los procedimientos, varios cultivos fueron enviados al laboratorio de enterobacterias del instituto Carlos Malbrán, donde se confirmaron los resultados obtenidos.
Análisis del lipopolisacárido
El estudio del patrón de LPS se realizó según el procedimiento de extracción descrito por Hictchok, con separación por el sistema discontinuo de Laemmli en geles de poliacrilamida a 12% sin SDS, y luego tinción con nitrato de plata(16,17).
]]> Estudio de la sensibilidad a los antimicrobianosLos ensayos se realizaron por la técnica de disco difusión en agar Müller-Hinton, siguiendo las normas del National Committe for Clinical Laboratory Standars (NCCLS)(18). Los antibióticos probados fueron los siguientes: tetraciclina (Tet), ceftriaxona (Ctx), ciprofloxacina (Cip), cefoxitina (Fox), ampicilina (Amp), trimetoprim-sulfametoxazol (Stx), cloranfenicol (Cm), ácido nalidíxico (Na), gentamicina (Gm) y nitrofurantoína (Fu) (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, England, UK).
Se utilizaron como cepas control Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
Perfil plasmídico
Las cepas se sembraron en caldo Luria Bertani (Sigma Chemical Co.; St. Louis) y se incubaron toda la noche a 37ºC con agitación. El ácido desoxirribonucleico (ADN) plasmídico se extrajo según el procedimiento de lisis alcalina(19). Los plásmidos obtenidos fueron analizados y visualizados por electroforesis en geles de agarosa a 0,7% con TBE 0,5X y tinción con bromuro de etidio.
Resultados
Se recuperaron durante los cuatro períodos mencionados, además de las 50 cepas de Shigella flexneri estudiadas en este trabajo, 25 cepas de Shigella sonnei, dos cepas de Shigella dysenteriae (ambas del serotipo 2) y una cepa de S. boydii.
]]>
Dentro del serogrupo B la distribución general por serotipos fue la siguiente: 34 cepas eran del serotipo 2a (68%); nueve del serotipo 3c (18%); dos del serotipo 4 (4%); dos del serotipo 6 (4%); dos del serotipo 1 (4%) y una no tipificable.
Todas las cepas del serotipo 2a mostraron el mismo patrón de LPS, a su vez diferente a los patrones de los otros serotipos ensayados. La figura 1 muestra algunos resultados representativos. Se observan las bandas características, correspondientes a moléculas de LPS liso que difieren de tamaño entre sí en una unidad repetitiva del antígeno polisacarídico O. La ubicación de la densidad máxima de bandas y la separación entre las mismas varía para cada serotipo.
La distribución de los serotipos de Shigella flexneri en los diferentes períodos de estudio se muestra en la figura 2. En todos los lapsos considerados fue predominante el serotipo 2a; en 1989-1990 se presentaban minoritariamente el 3c y el 6; en 1990-1994 el 4, el 1, y especialmente el 3c; en 1999 ninguno y en 2001-2003 nuevamente el 3c y el 1.
De acuerdo con los resultados de los ensayos de sensibilidad para ampicilina, cloranfenicol, tetraciclina y trimetoprim-sulfametoxazol, se identificaron 10 antibiotipos diferentes que se designaron según su fecha de aparición: tipo A (sensible a Amp, Cm, Tet, Sxt) 17 cepas; tipo B (Cm, Sxt, Tet)R dos cepas; tipo C (Sxt, Amp, Tet)R una cepa; tipo D (Amp)R dos cepas; tipo E (Sxt)R una cepa; tipo F (Sxt, Amp)R una cepa; tipo G (Cm, Sxt; Amp, Tet)R 11 cepas; tipo H (Cm, Amp, Tet)R 11 cepas; tipo I (Cm, Sxt, Amp)R dos cepas y tipo J (Amp, Tet)R dos cepas.
Ninguna de las cepas de S. flexneri estudiadas mostró resistencia para ácido nalidíxico, ciprofloxacina, nitrofurantoína, gentamicina, cefoxitina o ceftriaxona.
]]> La distribución de los distintos antibiotipos encontrados en los diferentes períodos de estudio se muestra en la figura 3. Se observa la predominancia inicial del tipo A, que era sensible a todos los antibióticos ensayados, y su progresiva desaparición posterior, con prevalencia creciente de los tipos G y H, de resistencia múltiple.
Se encontraron siete patrones de perfil plasmídico. En las cepas de los serotipos 6, 1 y 3c se encontró en cada tipo un patrón predominante, designados 1, 2 y 5, respectivamente. En los cultivos del serotipo 2a, el patrón 5 fue el más frecuente (31 aislamientos) seguido por el 6 (dos cepas) y el 7 (un aislamiento) (tabla 1). La figura 4 muestra resultados característicos de separación electroforética de plásmidos en gel de agarosa. Se observan tres perfiles diferentes del serotipo 2a, el patrón predominante de corrida del tipo antigénico 3c y el único observado en el serotipo 1.
Discusión
Las infecciones por Shigella aparecen como un problema importante para los servicios de Salud Pública en Uruguay, como sucede en otras regiones del mundo(2). En nuestro medio este germen sigue siendo el agente bacteriano más frecuentemente recuperado a partir de casos de diarrea con sangre en niños menores de 5 años y usuarios de los servicios de Salud Pública; se recupera en aproximadamente 20%-25% de los niños con esta enfermedad(20). En el período 1990-2000 se aislaron de niños atendidos en el Centro Hospitalario Pereira Rossell, 213 cepas de Shigella(21). La mayoría correspondían a S. flexneri y la situación parece ser diferente en niños usuarios de salud privada, en los cuales se han informado frecuencias de recuperación de 4%(22).
]]> Como ocurre en otras regiones poco desarrolladas del mundo, S. flexneri (grupo B) es el serogrupo predominante, seguido por S. sonnei y S. boydii.
Durante todo el período de estudio se recuperaron en el Departamento de Bacteriología y Virología solamente dos cepas de Shigella dysenteriae, que fueron del serotipo 2(14,20). En otras regiones pobres, este serogrupo es más común, y el serotipo predominante suele ser el 1(2).
Dentro del serogrupo B, el serotipo mayoritario y aislado en todos los períodos que incluye el estudio fue el 2a. Si bien estos hallazgos coinciden con resultados encontrados en otras partes del mundo(11) y en zonas definidas de países de la región(12), existen diferencias importantes con respecto a la frecuencia relativa hallada para los serotipos distintos del 2a.
Como sucede en otras regiones, los resultados obtenidos en esta población de niños sugieren una relativa estabilidad en la distribución de los serotipos a lo largo del tiempo (figura 2).
Estas dos observaciones (estabilidad y predominancia del tipo 2a) tendrían importancia, como discutiremos más abajo, para definir qué determinantes antigénicos debería incluir una vacuna para uso en este grupo de niños.
El estudio del perfil plasmídico mostró pocas diferencias dentro del conjunto de cepas del serotipo 2a (tres patrones distintos con un patrón predominante, el 5, como se muestra en la tabla 1). En los otros serotipos recuperados se encontró también una correspondencia importante entre tipo antigénico y perfil plasmídico. Aunque debemos tener en cuenta que el número de cepas estudiadas es bajo para estos serotipos, los resultados sugieren, en general, una cierta uniformidad en la distribución de los cultivos según el marcador plasmídico; el antibiotipo indica sin embargo, una diversidad importante dentro de los diferentes serotipos (tabla 1). Es necesario complementar los resultados de análisis plasmídico con técnicas de mayor poder discriminatorio que permitan establecer similitudes o diferencias, o ambas, a nivel genético entre cepas del mismo serotipo, para definir líneas celulares prevalentes. Esto puede ser importante si se considera la posibilidad de seleccionar las mismas en una estrategia de prevención con cultivos atenuados.
Los estudios de sensibilidad in vitro mostraron globalmente una elevada resistencia de S. flexneri a los antimicrobianos más comúnmente utilizados en el tratamiento de la shigelosis. Del total de las cepas estudiadas, 60% fueron resistentes a ampicilina y 36% a trimetoprim-sulfametoxazol. En el período 2001-2003 el porcentaje de resistencia para ampicilina fue de 94% y para trimetoprim-sulfametoxazol 44%, cifras claramente más altas que las registradas en el año 1989: 10% y 30%, respectivamente.
]]> El intercambio de material genético entre cepas y la presión de selección pueden explicar estos hechos. La combinación de sulfametoxazol y trimetoprim ha sido muy usada en nuestro medio para el tratamiento de infecciones pediátricas. Actualmente los antimicrobianos más frecuentemente indicados en el Centro Hospitalario Pereira Rossell son los betalactámicos, en orden, cefradina, aminopenicilinas, ceftriaxona y cefuroxime(23).Como era de esperar, el análisis de la evolución en el tiempo de los antibiotipos circulantes mostró una clara tendencia hacia la aparición de tipos con mayor espectro de resistencia (G, H, I, con resistencia para cuatro y tres antibióticos respectivamente, véase figura 3). Actualmente circularían tres serotipos de S. flexneri: 2a el más frecuente, seguido por 3c y 1, y cinco antibiotipos diferentes: G (Cm, Sxt, Amp, Tet)R, H (Cm, Amp, Tet)R , I (Cm, Sxt, Amp)R , J (Amp, Te)R y A (sensible a Amp, Cm, Tet, Sxt), con predominio de los primeros. Quedarían como recursos para el tratamiento de las infecciones por estas cepas de S. flexneri el ácido nalidíxico, la furazolidona o la ceftriaxona. Sin embargo, en lugares donde se utiliza el ácido nalidíxico es frecuente la aparición de cepas resistentes(6). En el caso de ceftriaxona, sólo se dispone de la preparación de uso parenteral y no existe en el mercado local furazolidona para uso en seres humanos.
El caso de Shigella sonnei sería diferente del de S. flexneri. Como sucede en África y Asia(6), durante el período 2001-2003 sólo se recuperaron dos antibiotipos: (Amp)R cuatro cepas y (Amp)S cinco cepas. Estos resultados llaman la atención, teniendo en cuenta la frecuente variación en el tiempo de los diferentes antiobiotipos de S. flexneri, y considerando también que varios elementos genéticos móviles (plásmidos, transposones) hallados en cepas de Shigella son importantes en la diseminación de resistencia(24,25). S. sonnei podría estar expuesta a menor presión de selección porque circula menos en el medio, los procesos que origina son menos severos y las consultas con tratamiento instituido menos frecuentes.
Un aporte útil de este estudio es la información que ofrece para la formulación de vacunas de aplicación en niños usuarios de Salud Pública. De acuerdo con las características del LPS se reconocen actualmente 47 serotipos dentro del género Shigella; por lo tanto parece poco práctico construir y luego utilizar una vacuna multivalente que los contenga a todos: es fundamental seleccionar los prevalentes.
El LPS de Shigella es importante como factor de virulencia y como inmunógeno potencial. Niveles críticos de IgG sérica e IgA mucosa contra el dominio "O" específico (O-SP) de este antígeno conferirían inmunidad serotipo específica para la shigelosis(26,27). Estudios en seres humanos mostraron que la inmunización con O-SP conjugado con diferentes proteínas determinó aumentos significativos en el nivel de anticuerpos (IgG) anti LPS(8). Teniendo en cuenta las reacciones cruzadas que ocurren dentro de los serotipos incluidos en el serogrupo B (con la excepción del 6), y los datos de ensayos clínicos que apoyan o sugieren algún grado de protección cruzada(9), el inmunógeno a ensayar para uso local debería incluir los O-SP de los serotipos 2a, 1, 3c, 4, 6 y también el de Shigella sonnei. En caso de ser 100% efectivo, este inmunógeno protegería a estos niños de la mayoría de las infecciones por Shigella.
Agradecimientos
Al doctor Juan Alfonso Ayala Serrano (Universidad Autónoma de Madrid, España) por la lectura crítica del manuscrito.
Summary
]]> Background: Shigella flexneri is the most frequent bacterial agent in infants under 5 years old with bloody diarrhea. Shigellosis is an infectious disease successfully treated with antibiotics. Empirical choice of the adequate antibiotic is difficult due to Shigella-resistant antibiotics. This situation promoted the interest to develop vaccines able to control the disease. Since many vaccines tend to promote specific serotype immune response, it is important to categorise prevalent serotypes in the population study. The aim of the study was to categorise 50 isolated Shigella flexneri strains in infants with bloody diarrhea, collected in four etiologic surveys of gastroenteritis.Methods: serotypification, lipopolysaccharide patterns, plasmid profile and sensitivity to different antibiotics were carried out in each strain.
Results: prevalent serotypes were 2a, 3c, 4, 6, y 1. Ten different antibiotypes were identified. In serotype 2a, 3 plasmidic patterns were found; 5 was the most frequent, followed by 6 and 7. Analyse of present antibiotypes showed a trend to an enlargement of the resistance range.
Conclusions: according to results, immunogen should include specific "O" determinants for 2a, 1, 3c, 4, 6 and Shigella sonnei serotypes.
Résumé
Introduction: chez des enfants de moins de 5 ans avec diarrhée sanglante, Shigella flexneri est l’agent bactérien le plus fréquemment repéré dans notre pays. La shigellose est une des maladies infectieuses où le traitement avec antimicrobiens est effectif. Le choix empirique de l’antimicrobien adéquat est problématique étant donné la résistance de Shigella à plusieurs antibiotiques. De là l’intérêt pour le développement de vaccins pour contrôler cette maladie. Certains vaccins visent à promouvoir la réponse immune sérotype spécifique; il est donc important d’établir la distribution de sérotypes prévalents dans la population à immuniser. Le but de cette étude est de caractériser 50 cèpes de Shigella flexneri isolées à partir d’enfants avec diarrhée sanglante, récupérées à quatre enquêtes étiologiques de gastroentérite.
Méthodologie: on a réalisé pour chacune sérotypifica-tion, étude du code de lipopolysacaride, profil plasmidique et étude de sensibilité à de différents antimicrobiens.
Résultats: les sérotypes prévalents ont été 2a, 3c, 4, 6 et 1. On a identifié 10 antibiotypes différents. Dans les cultures du sérotype 2a on a trouvé 3 patrons plasmidiques; le 5 en est le plus fréquent et après le 6 et le 7. L’analyse de l’évolution des antibiotypes circulants a montré une tendance vers l’apparition de types à plus grand spectre de résistance.
]]> Conclusions: il en résulte l’intérêt à essayer un immunogène qui inclut les déterminants "O" spécifiques des sérotypes 2a, 1, 3c, 4, 6 et celui de Shigella sonnei.
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