Funcionamiento de un biosensor

Dispositivos como los sensores químicos que se caracterizan por su potencial bajo coste, su capacidad para monitorear en continuo la calidad química y microbiológica de un producto, con tiempos de respuesta rápidos, pueden satisfacer las exigencias de la industria alimentaria.

Los sensores químicos pueden ser clasificados de acuerdo con el mecanismo que les confiere la especificidad química. Un biosensor pertenece a un subgrupo de sensores químicos que incorpora un elemento de detección biológica o biomimético. Los principales materiales biológicos utilizados en la tecnología de biosensores son las parejas de enzima/sustrato, anticuerpo/antígeno y ácidos nucleicos/ secuencias complementarias. La selectividad del elemento de detección biológica ofrece la oportunidad para el desarrollo de dispositivos altamente específicos para el análisis en tiempo real de mezclas complejas (Velasco-García y Mottram, 2003). En la industria alimentaria las principales áreas de interés para la aplicación de biosensores son la detección de patógenos, pesticidas, microorganismos y toxinas (^{Mello y Kubota, 2002}).

El elemento de reconocimiento biológico de un biosensor se puede clasificar en dos clases principales): biocatalizadores (enzimas, tejidos, etc.) y bioligandos (anticuerpos, ácidos nucleicos, lectinas, etc.). Los transductores tradicionales son de tipo electroquímico, óptico y térmico. La última generación de biosensores (Figuras 1 y 2) combina los principios de medición clásicos con transductores piezoeléctricos y magnéticos.

Figura 1: Esquema de un biosensor (^{Torres Ramírez y Méndez Albores, 2014}). 

Figura 2: Componentes de un biosensor (modificado de ^{Adley, 2014}). SPR: Resonancia de Plasmones de Superficie. FTIR: Espectroscopia Infrarroja por Transformada de Fourier. QCM: Microbalanzas de Cristal de Cuarzo. SAW: Onda Acústica de Superficie. 

Aplicaciones de los biosensores

No hay muchas experiencias documentadas de utilización de biosensores en hortalizas de IV gama, sin embargo, sí hay trabajos que presentan su uso en frutas y hortalizas en general, lo que puede asumirse como el antecedente de su aplicación en la industria de los productos listos para consumir. En la post-cosecha de frutas y hortalizas las preocupaciones más importantes son 1) la detección de residuos de plaguicidas, 2) el control de calidad en atmósferas modificadas, 3) la detección de patógenos y toxinas en frutas y verduras, y 4) la calidad nutricional.

1) Detección de residuos de plaguicidas. Un informe reciente de la Agencia Europea de Seguridad Alimentaria (^{AINIA, 2014}) refleja que el 44 % de las muestras recogidas de frutas y verduras europeas contiene restos de productos fitosanitarios. ^{Amine et al. (2006}) estimaron que alrededor del 71 % de las aplicaciones descritas para los biosensores enzimáticos son para la determinación de plaguicidas, incluidos los carbamatos y compuestos organofosforados, mientras que la detección de metales pesados representaba solamente el 21 %. Los biosensores enzimáticos se basan principalmente en la inhibición por parte del pesticida de la reacción de la enzima acetilcolinesterasa (AChE) y su sustrato, la acetilcolina (Figura 3). El pesticida se une al sitio esteárico activo de la enzima, inhibiendo su actividad biocatalítica, efecto que se combina con diferentes métodos de transducción de la señal.

Figura 3: Reacción enzimática de la acetilcolinesterasa. En ausencia del inhibidor la enzima hidroliza la acetilcolina en ácido acético y colina (^{Torres Ramírez y Méndez Albores, 2014}). 

^{Velasco-García y Mottram (2003)} presentan en su revisión algunas aplicaciones basadas en transductores sensibles a pH, en los que en ausencia del pesticida inhibidor la hidrólisis de la acetilcolina por la AchE libera acético que acidifica el medio, de forma que a menor pH menor concentración de pesticida en el medio. Estos transductores se aplicaron con éxito para la cuantificación del pesticida propoxur en muestras de cebolla y lechuga para la determinación de iones de metales pesados y pesticidas organofosforados en patatas.

^{Nagatani et al. (2007}) desarrollaron un chip visual para la detección de un pesticida organofosforado basado también en AchE, que permitía diferenciar entre concentraciones de 0,1 ppm y 0,2 ppm en muestras reales de manzana y zumo de naranja. En presencia del pesticida la enzima está inhibida y no aparece coloración en el chip (Figura 4).

Figura 4: Decoloración gradual de los chips desechables a medida que aumenta la concentración del pesticida diazinon-oxon (DZN-oxon) (^{Nagatani et al., 2007}). 

^{Cesarino et al. (2012}) desarrollaron un biosensor amperométrico basado en la acetilcolinesterasa inmovilizada en una estructura de nanotubos de carbono y polianilina, para cuantificar los insecticidas carbamatos metomil y carbaril en muestras licuadas de manzana, col y brócoli.

2) Control de calidad en atmósferas modificadas. La determinación de etanol en envases de atmósfera modificada como los que habitualmente se emplean en los productos de IV gama se puede utilizar como un indicador de anoxia y por tanto para detección de daños en condiciones de bajo oxígeno en las atmósferas en las que se almacenan frutas y verduras. Los sensores de etanol más prometedores desarrollados hasta la fecha son los sensores bi-enzimáticos basados en la co-inmovilización de la enzima alcohol oxidasa con la peroxidasa. En presencia de la enzima alcohol oxidasa el etanol se oxida a acetaldehído y H₂O₂, el cual se oxida a su vez por la peroxidasa que lo reduce aún más a H₂O liberando oxígeno. Este sistema se ha utilizado para desarrollar sensores colorimétricos comerciales y desechables, capaces de detectar daños por bajo O₂ en paquetes de atmósfera modificada que contienen frutas y verduras mínimamente procesadas (^{Azevedo et al., 2005}). Junto con las enzimas se fija en el chip un compuesto cromogénico el 2,2´-azino-di(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) o ABTS, que al oxidarse con el oxígeno adquiere un color verde azulado. El viraje de color del cromógeno indica la detección de etanol en el espacio de cabeza del interior de las bolsas de IV gama.

^{Schlangen, Haemmerle y Moos (2012}), desarrollaron un biosensor enzimático amperométrico para la detección de alcoholes volátiles en el espacio de cabeza de zumos de frutas y vegetales. El principio del sensor se basa en la oxidación de etanol a acetaldehído catalizada por la enzima alcohol oxidasa. El H₂O₂ producto de la reacción se oxida en el electrodo de platino, generando una señal eléctrica medible proporcional a la concentración del alcohol. El sensor fue capaz de detectar alcoholes volátiles (metanol y etanol) en zumos de tomate, uva, grosella y manzana. No pudo diferenciar entre etanol y metanol, pero puede utilizarse para realizar una detección rápida de estos volátiles como screening previo de las muestras que deben ir a su análisis a laboratorio.

3) Detección de patógenos y toxinas en frutas y verduras. De acuerdo con ^{Lazcka, Campo y Muñoz (2007}), los biosensores son la tecnología de más rápido crecimiento para la detección de patógenos, siendo posible en un futuro próximo que esta técnica de análisis pueda sustituir la prueba de referencia ELISA. Esta es un gran área de interés, no sólo debido al potencial de los biosensores como indicadores de toxicidad, sino también como indicadores de la calidad, frescura o el deterioro de frutas y verduras (^{Velusamy et al., 2010}; ^{Saaid et al., 2009}).

^{Chai et al. (2013}) utilizaron un biosensor magnetoelástico (ME) para la detección de Salmonella typhimurium en la superficie de tomates. Los biosensores ME constan de un transductor (un resonador ME) y un receptor específico para bacterias patogénicas. Cuando el biosensor entra en contacto con las bacterias diana específicas, las bacterias son capturadas y ligadas a la superficie del biosensor por el elemento de reconocimiento biomolecular, en este caso el bacteriófago filamentoso E2 específico para S. typhimurium. Esta unión incrementa la masa del sensor provocando un descenso en la frecuencia resonante proporcional al número de células bacterianas ligadas a la superficie del biosensor. Se utiliza una electro-bobina magnética para generar el campo magnético oscilante y medir la frecuencia de resonancia (Figura 5). Con este novedoso dispositivo la presencia de Salmonella se analiza in-situ y en tiempo real con un límite de detección inferior a 1,5·10³ ufc/mm².

Figura 5: Esquema del modo de utilización del biosensor magnetoelástico (ME) sobre la superficie de un alimento (modificado de ^{Suiqiong et al., 2010}; ^{Chai et al., 2013}). 

Por otro lado, el desarrollo sobre los frutos de hongos de los géneros Aspergillus y Penicillium produce micotoxinas. ^{Leung, Shankar y Mutharasan (2007}), en su revisión sobre biosensores de fibra óptica, describen un sensor fluorescente para detectar fumonisinas y aflatoxinas en maíz, utilizando por una parte un ensayo competitivo para medir la fumonisina B-1 (FB1): el anticuerpo a FB1 se unió covalentemente a la fibra, la señal de fluorescencia fue inversamente proporcional a la concentración de FB1. Por otra parte, la aflatoxina B-1 (AFB (1)) se detectó usando un ensayo no competitivo, porque la AFB(1) emite fluorescencia. La señal fluorescente en este caso era directamente proporcional a la concentración de AFB (1). El límite de detección fue de 2 ng/ml de AFB (1).

4) Calidad nutricional. La afinidad de los biosensores por compuestos específicos permite desarrollar dispositivos para la detección de compuestos de interés nutricional como azúcares o antioxidantes. La glucosa es el principal monosacárido encontrado en casi todas las frutas y se puede utilizar como un indicador de su índice glucémico. Por lo tanto resulta de interés el desarrollo de biosensores simples, fiables y económicos de glucosa para frutas. ^{Ang, Por y Yam (2015}) han desarrollado un biosensor enzimático amperométrico basado en la inmovilización de glucosa oxidasa (GOD) sobre una membrana inerte de quitosano fijada a continuación sobre un electrodo de platino. El principio básico de este biosensor es la cuantificación de la glucosa mediante la detección electroquímica del H₂O₂ liberado enzimáticamente (Figura 6). Se evaluó el comportamiento del biosensor mediante la determinación del contenido de glucosa en homogeneizados de manzanza, pera, mango, sandía, plátano y naranja. Su precisión fue similar a la de un kit de ensayo de glucosa comercial, con un límite de detección de 5mM.

Figura 6: Reacción completa catalizada por la glucosa oxidasa (GOD). 

Limitaciones en el uso de biosensores

A pesar de las aplicaciones descritas en los párrafos anteriores, hay pocas publicaciones sobre biosensores aplicados a la tecnología postcosecha o a los productos de IV gama y muy pocos producidos a nivel comercial en general (Figura 7).

Figura 7: Biosensores comerciales para la industria alimentaria (adaptado de ^{Costa-Silva et al., 2013}). 

Una observación importante es que la mayoría de los biosensores citados están diseñados para utilizar muestras en fase líquida, mostrando que el enfoque no destructivo está todavía muy lejos en el caso de muestras sólidas. En general, algunos de los principales inconvenientes que los biosensores tienen que superar son la limitada vida útil de los componentes biológicos, la falta de selectividad en matrices complejas reales, la necesidad de mejora de los dispositivos sensores en cuanto a la sensibilidad y la reproducibilidad y el elevado coste, cuya reducción pasa por la producción comercial en masa.

En el caso concreto de la aplicación de biosensores en el control microbiano de los alimentos, hay aspectos que no siempre se tienen en cuenta como la heterogeneidad espacial de la matriz alimentaria y de la distribución de los microorganismos en la misma, que puede estar influenciada por variables como la porosidad, las propiedades viscoelásticas y los atributos físico-químicos de los alimentos, tales como pH, actividad de agua y capacidad de difusión de los nutrientes y/o metabolitos. Estos efectos son un factor limitante en la aplicabilidad de la tecnología de biosensores en este campo (^{Adley, 2014}).

Futuro de los biosensores

La construcción de sistemas integrados que utilicen un conjunto de biosensores para la fabricación de autoanalizadores de alta especificidad necesita mejorar o diseñar nuevas tecnologías de sensores (receptores y transductores) y tecnologías de fabricación automatizadas para eliminar la variabilidad lote a lote y hacerlos aptos para la producción comercial en masa, y la integración de la matriz de sensores con un sistema de extracción de muestra apropiado.

La información aportada por los biosensores se puede integrar en sistemas de trazabilidad y de información al consumidor basados en el «internet de las cosas». ^{Zhao et al. (2015}) proponen un sistema basado en un biosensor de AChE para detectar residuos de clorpirifos en muestras reales de ocho tipos de verduras y frutas (pepino fresco, judías, espinacas, col, frijol, manzana, tomate y lechuga) con un límite de detección de 2 μg/l. El detector imprime el resultado de la analítica en un código QR que se adhiere al envase con el producto y que puede ser consultado por el consumidor en cualquier punto de la cadena de valor y obtener información sobre el contenido de pesticidas del producto (Figura 8).

Figura 8: Arquitectura del sistema de detección de pesticidas (figura superior); modelo de la plataforma propuesta de intercambio de información (figura inferior) (modificado de ^{Zhao et al., 2015}). Código QR: código de respuesta rápida. 

Por último, hay al menos otros dos desarrollos que se espera tengan un impacto significativo en el área de biosensores: el laboratorio en un chip y la nanotecnología. Los nano alambres semiconductores de óxido de metal o nanotubos se pueden utilizar para la fabricación por ejemplo de sensores de gases y biosensores electroquímicos. Estas nanoestructuras cuasi-unidimensionales son esenciales para el avance en el desarrollo de sensores químicos y tendrán un impacto importante en la exploración de dispositivos a nanoescala (^{Liu, 2008}; ^{Xia, Wei y Wan, 2010}), para la fabricación de microlaboratorios tamaño de tarjetas de crédito e incluso para la detección in vivo.

Fundamentos

La IH es un término amplio que engloba todas aquellas técnicas que permiten obtener datos espectrales con resolución espacial mediante el uso de la fluorescencia, la espectroscopia IR y VIS o la espectroscopia Raman. Aúna las potencialidades de la espectroscopia y la imagen convencional, al obtener espectros para todos los píxeles de una imagen (Figura 9) con resoluciones espaciales que pueden variar del nivel de una sola célula al de un objeto macroscópico (un alimento).

Figura 9: Cubo de datos (o hipercubo) de una IH: dos dimensiones espaciales y una tercera dimensión espectral (adaptado de ^{Riccioli, 2011}). 

La Figura 10 muestra el esquema habitual que se sigue para preprocesar, analizar y establecer los modelos de predicción cuantitativos o cualitativos a partir de una imagen hiperespectral. El preprocesado permite la corrección de la imagen eliminando cualquier efecto interferente que pueda deberse a una iluminación deficiente o a la morfología del objeto, y la eliminación del fondo, de modo que el proceso continúa sólo en los píxeles correspondientes a la región de interés. Posteriormente se suele realizar un análisis estadístico exploratorio para establecer, si es posible, aquellas longitudes de onda que presentan mayor variabilidad y por tanto pueden ser las más relevantes en el fenómeno bajo estudio. Sin embargo, en la IH en el visible y en el infrarrojo, las longitudes de onda suelen estar muy correlacionadas y se requiere la aplicación de técnicas quimiométricas de análisis multivariante como análisis de componentes principales (PCA) para establecer modelos, normalmente cualitativos. La determinación de modelos cuantitativos en muchas ocasiones resulta muy complicado, pues los modelos basados en los patrones espectrales han de relacionarse con valores de referencia química que no pueden proceder de un único píxel, sino que son un valor medio representativo de la muestra.

Figura 10: Esquema con los pasos habituales en el análisis de imágenes hiperespectrales (modificado de ^{Gowen et al., 2015}). 

En los últimos años la IH ha alcanzado un amplio reconocimiento como una técnica rápida y no destructiva para la determinación de diferentes parámetros de calidad y seguridad en numerosos alimentos. En trabajos de revisión recientes se presentan catálogos de aplicaciones que ilustran la capacidad de la técnica en la clasificación de productos, en la detección de defectos y enfermedades, en la distribución espacial de la composición química o en la evaluación general de la calidad de productos como carnes, pescados, frutas y vegetales y otros alimentos (^{Wu y Sun, 2013}a, ^2013b).

Más concretamente, en los últimos 10 años la IH se ha aplicado también a la caracterización microbiológica de sustratos (^{Gowen et al., 2015}), trabajando tanto a nivel microscópico y aplicando imagen de espectroscopia Raman de dispersión o de espectroscopia VIS/NIR (^{Park et al., 2015}), como a nivel macroscópico. Las primeras investigaciones a escala macroscópica se llevaron a cabo estudiando el crecimiento de bacterias en agar o depositadas sobre superficies de aluminio o acero inoxidable, para posteriormente estudiar también la viabilidad de la técnica directamente sobre alimentos. En los siguientes apartados se incluyen algunos trabajos representativos de estas aplicaciones a nivel macroscópico, que es el que más se aproxima a la posible implantación de la técnica en los entornos productivos.

Detección e identificación de microorganismos en superficies estructuradas

En uno de los primeros trabajos en el área, ^{Dubois et al. (2005}) evaluaron la posibilidad de usar la IH NIR (1000-2350 nm) como un sistema de alto rendimiento para la diferenciación de bacterias y la identificación de microorganismos patógenos. En una placa de aluminio con 64 pocillos de 2 mm de profundidad y 1 mm de diámetro se depositaron sendas suspensiones salinas conteniendo los microorganismos a identificar: Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella typhimurium y Salmonella entiritidis. Se permitió la desecación de los pocillos antes de adquirir las imágenes hiperespectrales. La distinción entre las especies Gram positivas y las Gram negativas (E. coli y Salmonella spp.) se basó en las diferencias de intensidad del espectro a 1.940 nm, longitud de onda relacionada con los enlaces de las moléculas de agua. Los distintos contenidos en humedad de unas especies frente a otras podrían explicarse como una consecuencia de la protección frente a la deshidratación que confiere la membrana externa en las Gram negativas. Por otro lado, la intensidad del espectro a 1.685 nm, relacionada con los dobles enlaces cis de las grasas insaturadas, permitió la segregación de B. cereus del resto de las especies. Se establece así la viabilidad de la IH, que a través de unas pocas bandas espectrales, provee de una herramienta de alto rendimiento que facilita los procedimientos convencionales para la detección de ciertos patógenos. La aplicación de un análisis discriminante a partir de dos clases, la constituida por Salmonella y la formada por Escherichia, permitió establecer un modelo de detección para responder a la pregunta de si en una muestra está presente o no uno de los dos microorganismos patógenos.

Otras investigaciones se han dirigido a la detección de ciertos microorganismos directamente en agar. ^{Yoon y Lawrence (2010}) han aplicado la IH en el rango comprendido entre 400 y 900 nm para distinguir entre colonias de Campylobacter y colonias de otros contaminantes no Campylobacter en un estadio de evolución temprano (a las 24 horas de incubación). Para ello se generó una librería de patrones espectrales correspondientes a 11 especies contaminantes de Campylobacter y otras seis especies contaminantes no Campylobacter, para identificar las principales bandas de absorción y generar los correspondientes modelos de segregación (Figura 11). Con un índice basado en dos longitudes de onda (426 y 458 nm) se consiguió un nivel de acierto del 97 %.

Figura 11: Esquema de la siembra sobre placa de agar de especies contaminantes (arriba) y los patrones espectrales medios de Campylobacter, no Campylobacter y agar a las 24 h de incubación (^{Yoon y Lawrence, 2010}). 

Detección e identificación de microorganismos en alimentos

La identificación, clasificación y cuantificación del crecimiento microbiano directamente sobre la superficie de alimentos mediante IH supondría un procedimiento alternativo para la detección precoz de contaminaciones microbianas. Las aplicaciones a nivel microscópico no son viables en matrices alimentarias, por lo que la mayor parte de los trabajos se ha centrado a escala macroscópica en imágenes en los rangos visible e infrarrojo muy cercano (400-1000 nm) e infrarrojo (900-1.700 nm). Sin embargo, en general, la técnica ha mostrado su potencial en la detección de los efectos secundarios del crecimiento de los microorganismos en el alimento o en la identificación de contaminaciones sospechosas, como la presencia de restos fecales frecuentemente asociadas a la presencia de coliformes. En este sentido hay una amplia trayectoria de investigaciones que persigue la identificación de carcasas de pollo con restos fecales en superficie, llegando a proponer sistemas de evaluación en línea (^{Park et al., 2006}, ²⁰¹¹).

La estimación de microorganismos viables totales en productos avícolas, cárnicos y pescados ha sido el objetivo de diversos trabajos, con resultados esperanzadores. Por ejemplo, ^{Feng y Sun (2013}), con imágenes en el rango NIR, establecieron modelos completos (incluyendo la totalidad del espectro) y simplificados (con selección de las longitudes de onda más relevantes), obteniendo en el mejor de los modelos un coeficiente de correlación y un error cuadrático medio de 0,94 y 0,5 log₁₀ ufc g^»1 en la validación cruzada. La visualización de los modelos permite identificar zonas con diferentes cargas microbianas (Figura 12).

Figura 12: Mapas de distribución de número de viables totales en filetes de pollo para diferentes modelos incluyendo el espectro completo (línea superior) y con selección de variables (línea inferior) (^{Feng y Sun, 2013}). 

Pero además de estimar el número total de bacterias, es de interés la identificación de grupos o géneros específicos, aproximándonos así a los estudios llevados a cabo sobre superficies estructuradas. Aplicando un esquema similar al expuesto para la estimación de viables totales, ^{Feng y Sun (2013}), también en carne de pollo, establecieron modelos de predicción de población de enterobacterias, alcanzando errores cuadráticos medios de 0,45 log₁₀ ufc g^»1, con las determinaciones comprendidas en el rango de 2,75 a 5,43 log₁₀ ufc g^»1 (Figura 13).

Figura 13: Imagen virtual de la estimación de contenido en enterobacterias en carne de pollo (los tonos corresponden a distintos contenidos) (^{Feng y Sun, 2013}). 

En lo que refiere a productos vegetales, las investigaciones publicadas son menos. Con un carácter eminentemente aplicado, para tratar de sustituir la inspección visual en las líneas de clasificación, cabe mencionar una sucesión de trabajos que persiguen la detección precoz de los efectos causados por Penicillium sp. en cítricos. La Figura 14 muestra los patrones espectrales típicos de la superficie del fruto. Se consiguieron niveles de acierto comprendidos entre el 90 % y el 98 % identificando frutos con más de un 5 % de superficie de píxeles considerados como afectados por el microorganismo (^{Gómez-Sanchís et al., 2008}, ²⁰¹²).

Figura 14:  Patrones espectrales de la superficie de un cítrico sin defectos, afectada por trip y afectada por Penicillium spp. (^{Gómez-Sanchís et al., 2012}). 

En otros estudios recientes la IH en el rango de 400 a 1.000 nm se ha implementado para detectar la contaminación microbiológica de productos como hojas de espinacas, inoculadas con E. coli (^{Siripatrawan et al., 2011}) o con Listeria innocua (^{Aligbe, Diezma-Iglesias y Díaz-Barcos, 2013}; Figura 15), y champiñones con Pseudomonas tolaasi (^{Gaston et al., 2010}). La hipótesis es que la actividad metabólica de microorganismos inoculados a estos vegetales resultaría en cambios bioquímicos con la consecuente formación de productos metabólicos que podrían ser detectados por la IH, indicando así la contaminación del alimento. Es importante también distinguir entre estas alteraciones y los cambios bioquímicos normales que se suceden a lo largo de la vida útil de los alimentos (por ejemplo, el pardeamiento enzimático). En el estudio sobre los champiñones, en los que como en otros productos, tanto la actividad bacteriana como la enzimática dan lugar a la aparición de pardeamientos en la superficie, mediante el patrón espectral se ha podido distinguir entre los daños mecánicos y el deterioro microbiológico con un nivel de acierto del 95 %.

Figura 15: Espectros medios (arriba) correspondientes a regiones muy deterioradas (gris), no deterioradas (blanco fino) y de deterioro medio (blanco grueso). En las imágenes virtuales de asignación de regiones (abajo) a cada clase de deterioro le corresponde un tono: gris claro para píxeles no deteriorados, blanco para píxeles de deterioro medio y gris oscuro para píxeles deteriorados. Se muestran hojas inoculadas y no inoculadas al principio y al final de la conservación (^{Aligbe, Diezma-Iglesias y Díaz-Barcos, 2013}). 

Retos de la aplicación de la IH en calidad microbiológica de alimentos

A pesar de que a lo largo del artículo se han presentado ejemplos que demuestran el potencial de la IH como una herramienta alternativa útil para profundizar en el conocimiento fundamental de la microbiología de los alimentos y para la detección e identificación de determinados microorganismos, es evidente que existen limitaciones de la técnica que han de salvarse antes de estar en condiciones de ser transferida a la industria (^{Gowen et al., 2015}).

Para que pueda adquirirse la imagen de toda la superficie del producto, la presentación de la muestra es todavía una cuestión pendiente de cara a la supervisión en línea de los alimentos. La resolución espacial define el tamaño mínimo de la región que puede ser examinada; los sistemas de IH en aplicaciones macroscópicas presentan una resolución típica de 300 μm, lo que se traduce en que muestras contaminadas con pequeñas colonias no sean identificadas. Sin embargo, hay que buscar una solución de compromiso entre la resolución espacial, el campo de visión y la velocidad de adquisición de la imagen: una mejora de la primera se traduce en una disminución del campo de visión y de la velocidad de adquisición.

En las determinaciones microbiológicas un aspecto clave es el límite de detección. La mayor parte de los estudios se ha centrado en el análisis del deterioro de los alimentos o en la identificación de los niveles microbianos con cargas superiores a 10² ufc/ml. Aunque los estudios han de ampliarse a un mayor número de especies, puede ya afirmarse que la mayor parte de las técnicas de IH tienen un límite de detección superior al que puede alcanzarse con los procedimientos tradicionales, por lo que pueden tener limitada su aplicación a especies en las que los efectos en la calidad y seguridad de los alimentos se manifiestan a partir de elevadas cargas microbianas. La especificidad de la técnica también plantea dudas razonables. La capacidad de identificar y discriminar ciertos microorganismos en muestras en las que cohabitan otros muchos, por ejemplo en alimentos fermentados, es una tarea que requiere de la aplicación conjunta de las aproximaciones microscópica y macroscópica.