Aspectos generales

Las actividades de campo se realizaron durante los meses de marzo y abril de 2010, en La Estación Experimental La Estanzuela del Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria (INIA-LE) ubicada en el departamento de Colonia (34º 20’ S, 57º 41’ W). Se utilizó un semillero de trébol rojo de 200 x 250 m, sembrado con el cultivar Estanzuela 116, que había comenzado su segunda floración en torno al 20 de febrero. El estudio no se pudo hacer durante la primera floración porque no coincide completamente con el pico poblacional de abejorros, que corresponde a los meses de marzo y abril. Dos semanas antes de comenzar el trabajo en el semillero, se realizaron las tareas de búsqueda y trasferencia de nidos de abejorros a cajas-nido de madera (0,20 x 0,30 x 0,20 m). Los nidos se dejaron al menos un día en el lugar donde se encontraba la colonia trasegada para no perder las obreras que se encontraban en el campo y para que los individuos se adaptasen a las cajas. La noche previa al traslado de las colonias al semillero (4 de marzo) las cajas se cerraron para evitar la pérdida de pecoreadoras. El marcado de las parcelas experimentales (2 x 5 m) en el semillero se realizó la semana previa al inicio del trabajo. Durante el período de estudio, los diferentes registros en el semillero se llevaron a cabo los días: 6, 12, 17, 22, 27 y 31 de marzo y 7 de abril. El día 12 de abril se realizó la cosecha del semillero. Las tareas de laboratorio para determinar el rendimiento de semillas se realizaron en el Laboratorio de Semillas de INIA-LE.

Nidos de abejorros y parcelas experimentales

Durante el mes de febrero se encontraron siete colonias de B. atratus (con un promedio de 80 individuos) y tres de B. bellicosus (con un promedio de 106 individuos) que fueron trasladadas al semillero y colocadas a lo largo de uno de los lados del mismo con la entrada dirigida hacia el cultivo. Esto permitió incrementar la población de abejorros presentes en la pradera para poder evaluar su efecto como polinizadores del trébol rojo.

Para evaluar posibles efectos de la distancia a los nidos de abejorros, como sugieren estudios previos (^{Varela y Rebuffo, 1999}), se ubicaron cinco réplicas de las parcelas a 40, 80, 120, 160 y 200 metros desde la ubicación de los nidos, totalizando 25 parcelas experimentales.

El día 4 de marzo, antes de iniciar los registros de presencia de abejorros, se eliminaron de las parcelas experimentales todas las inflorescencias maduras (aquellas que ya habían semillado o estaban marchitas, caracterizadas por una coloración marrón). Las inflorescencias que poseían más del 25 % de la cabezuela con flores de color rosado fuerte (flores inmaduras o receptivas, que son atractivas para los abejorros) fueron contadas en cada día de registro de la actividad de los abejorros en la pradera.

Actividad de los abejorros

La actividad de los abejorros sobre la pradera se evaluó en tres momentos del día durante todo el período de estudio: mañana (8-12 horas), mediodía (13-16 h) y tarde (17-20 h). En cada parcela, de forma aleatoria, en un período de tres minutos, se registró el número de abejorros de cada especie que se encontraban pecoreando. Adicionalmente, se registró información sobre otros insectos (número y grupo taxonómico) observados pecoreando durante ese período.

De forma complementaria, se determinó la abundancia de abejorros en cuatro transectas ubicadas entre las parcelas a una distancia entre ellas de 10 m, desde los nidos al extremo final del semillero. Las transectas fueron recorridas a velocidad constante por un solo observador, registrando presencia y especie de los abejorros observados. Por otro lado, en los días que se registró la actividad de los abejorros durante la noche se evaluó el tamaño y las condiciones de los nidos de utilizados (presencia de hongos, higiene, etc.).

Rendimiento del cultivo

El 12 de abril se cosecharon las semillas del trébol rojo. Se lanzaron al azar dos cuadrantes de 0,5 x 0,5 m uno hacia el lado izquierdo y otro hacia el lado derecho desde el centro de uno de los laterales de cada parcela. En la superficie encerrada en el cuadrante, se contó el número de inflorescencias maduras e inmaduras, descartándose estas últimas.

De cada parcela se tomaron al azar 10 cabezuelas maduras que fueron trilladas individualmente y sobre las cuales se realizaron las determinaciones de los componentes de rendimiento a nivel de las inflorescencias (número de semillas y número de flores por cabezuela). En base a esos valores, se determinó el número de semillas por número de flores (cuajado).

El resto de las inflorescencias provenientes de los cuadrantes muestreados se trillaron y las semillas se limpiaron utilizando cribas y un Blower, descartando las semillas inmaduras. Las semillas limpias obtenidas se pesaron para determinar el rendimiento de semillas (g/m²) y, usando cuatro repeticiones de 100 semillas, se determinó el peso de 1000 de las semillas.

Análisis estadísticos

Para el análisis estadístico se utilizó el sistema SAS. Se tomó como base para el análisis un Modelo Lineal Generalizado (PROC GLM). En etapas posteriores se utilizó el PROC MIXED (Modelo Lineal Mixto) cuando el análisis consideró algunos efectos como aleatorios. Adicionalmente, se utilizó el PROC GENMOD (Modelo Lineal Generalizado) cuando las variables no cumplían los supuestos del análisis PROC GLM, generalmente debido a que los datos son mayoritariamente de conteo.

La distribución de los abejorros en función de la distancia a los nidos se analizó con los registros de las parcelas y las transectas por separado, utilizando un Modelo Lineal General (GLM) en el que se consideró a las distancias como variables cualitativas y se incluyó la fecha y la interacción fecha por distancia. De igual forma, se analizó la presencia de otros polinizadores a lo largo del periodo de estudio.

La asociación entre los diferentes indicadores de rendimiento de semillas y la presencia de abejorros se realizó utilizando el Coeficiente de Correlación de Pearson (PROC CORR).

En todos los análisis estadísticos se consideraron diferencias significativas cuando P fue menor a 0,05.

Tamaño de las colonias

La población inicial de las 10 colonias colocadas en el semillero varió entre 50 y 150 individuos (media ± DS: 99 ± 36). La población del conjunto de las colonias se redujo en torno al 50 % en los 10 días siguientes a su instalación. Sin embargo, luego de esta reducción inicial la población se mantuvo estable durante todo el período de estudio.

Evolución de las inflorescencias atractivas para los insectos

El número promedio de inflorescencias de trébol rojo atractivas para los insectos incrementó en forma sostenida entre el 6 y el 31 de marzo, pasando de 8,9 a 68,5 inflorescencias/ m² (Figura 1). Luego del 31 de marzo el número de inflorescencias atractivas experimentó una disminución importante llegando a 53 inflorescencias/m² el día 7 de abril (Figura 1).

Figura 1: Número de inflorescencias atractivas de trébol rojo (rosado fuerte) a lo largo del período de estudio. Cada punto resulta de calcular el número de inflorescencias por metro cuadrado usando el número promedio de inflorescencias en las 25 parcelas experimentales (2 x 5 m) para cada fecha 

Presencia de los abejorros en la pradera

El efecto de la distancia a los nidos en la distribución de los abejorros en la pradera mostró resultados diferentes entre las parcelas y las transectas. En las parcelas no se encontró relación en la densidad de abejorros con la distancia a los nidos al analizar las dos especies juntas (F = 1,39; P = 0,24) ni separadas (B. atratus F = 1,41; P = 0,22; B. bellicosus F = 0,39; P = 0,82) (Figura 2A). En cambio, cuando se analizaron los datos de las transectas se encontró que la distribución variaba con la distancia pero no de forma lineal (F = 6,72; P < 0,001). El mayor número de abejorros se encontró a 60 m de los nidos y el mínimo a 160 m, siendo la diferencia de casi 50 % (Figura 2B). Esta tendencia también se observó al analizar cada especie de abejorros por separado (B. atratus F = 6,41; P < 0,001; B. bellicosus F = 6,14; P < 0,001) aunque fue más notoria en B. atratus (Figura 2B).

Figura 2: Abundancia de abejorros (número promedio de individuos) en las parcelas (izquierda) y las transectas (derecha) en relación a la distancia a los nidos (A, B), el momento del día (C, D) y la fecha (E, F). 

En relación al efecto del horario en la distribución de los abejorros, los registros mostraron que la mayor cantidad de individuos se concentraba en horas del mediodía. Esta tendencia se observó en las parcelas (F = 4,89; P = 0,008) y en las transectas (F = 14,36; P < 0,001) cuando las especies se analizaron juntas (Figura 2C, D). No obstante, al analizar las especies por separado, la densidad de B. atratus se relacionó con el horario, siendo mayor al mediodía (F = 4,96; P = 0,007 en las parcelas; F = 8,17; P = 0,0003 en las transectas), mientras que la densidad de B. bellicosus no mostró diferencias a lo largo del día (F = 0,48; P = 0,62 en las parcelas; F = 1,27; P = 0,28 en las transectas) (Figura 2C, D).

La densidad total de abejorros en el semillero incrementó fuertemente a lo largo del período de estudio (F = 31,84; P < 0,0001 en las parcelas; F = 79,81; P < 0,001 en las transectas) (Figura 2E, F). El mismo resultado se obtuvo al analizar las dos especies de abejorros por separado: B. atratus (F = 26,51; P < 0,001 en las parcelas; F = 74,11; P < 0,001 en las transectas) y B. bellicosus (F = 13,26; P < 0,001 en las parcelas; F = 30,17; P < 0,001 en las transectas) (Figura 2E, F). Los registros de las transectas muestran que el principal incremento en la densidad de los abejorros ocurrió entre el 22 y el 27 de marzo (Figura 2E, F).

El número de individuos de B. atratus fue mayor que el de B. bellicosus a lo largo del período de estudio, excepto el primer día de registro en el cual ambas especies estaban presentes en la misma proporción (Figura 2E, F).

Se analizó la presencia de abejorros en la pradera en relación con el número de inflorescencias atractivas presentes en las parcelas encontrándose una asociación de acuerdo a la función: y = 0,01x + 1,2393 (F= 162,32; P < 0,001).

Otros insectos presentes en la pradera

Diversos insectos pertenecientes a Hymenoptera, Lepidoptera y Diptera fueron registrados forrajeando en las flores trébol rojo a lo largo del período de estudio. Los lepidópteros fueron los más abundantes durante la primera mitad del mes de marzo, especialmente Colias lesbia (Pieridae). Durante el resto del estudio, los abejorros fueron los insectos predominantes en el semillero. El tercer insecto más abundante fue la abeja melífera y luego algunas especies deabejas solitarias como Xylocopa augusti y X. artifex. Estas dos últimas especies fueron agrupadas junto a otras especies de himenópteros de baja abundancia en la categoría «otros himenópteros» (Figura 3).

Figura 3: Insectos observados pecoreando en las flores de trébol rojo en las parcelas experimentales a lo largo del período de estudio. 

El 22 de marzo, la densidad de los distintos insectos en la pradera cambió (Figura 3). A partir de esa fecha la presencia de A. mellifera (F = 7,37; P < 0,001) y de otros himenópteros (F = 24,79; P < 0,001) aumentó significativamente, mientras que la densidad de lepidópteros disminuyó significativamente (F = 13,89; P < 0,001). Los dípteros estuvieron presentes en muy baja proporción durante todo el período de estudio pero aumentaron levemente hacia el final del mismo (F = 2,26; P = 0,0366) (Figura 3).

Rendimiento del cultivo

Para cada una de las 25 parcelas experimentales se calcularon indicadores de rendimiento de la producción de semillas. No se encontró ninguna asociación entre el número de abejorros y las semillas/inflorescencia (ρ = 0,134; P = 0,52) o el peso de 1000 semillas (ρ = 0,04; P = 0,85). No obstante, se encontraron asociaciones significativas entre el número de abejorros y otros indicadores de rendimiento: número de inflorescencias maduras/m² (ρ = 0,394; P = 0,05), número de inflorescencias/m² (ρ = 0,421; P = 0,04) y rendimiento de semillas (g/m²) (ρ = 0,430; P = 0,03). La correlación entre el número de abejorros y el rendimiento de semillas (g/m²) siguió la función de regresión: Rendimiento = 1,06 + (0,57 x Nº abejorros). Esto significa que por cada dos abejorros que visitaron la parcela, el rendimiento de semillas (g/m²) se incrementó en una unidad.

Tamaño de las colonias de abejorros

El tamaño de las colonias de abejorros trasladadas al semillero fue variable pero no superó en ningún caso los 150 individuos, aunque B. atratus y B. bellicosus pueden formar colonias con hasta 400 individuos (^{Goulson, 2003}). La población de estas colonias estuvo determinada por su tamaño al momento de ser extraídas de su ubicación original y por las pérdidas durante el proceso de trasiego. En ese proceso, inevitablemente algunas obreras fueron dañadas o murieron y algunas pecoreadoras quedaron en el campo. Adicionalmente, como consecuencia del traslado, algunas pecoreadoras probablemente se perdieron ya que no lograron orientarse en el nuevo emplazamiento y no consiguieron regresar a sus nidos. La pérdida de obreras experimentada en los primeros días luego de instaladas las colonias en el semillero de trébol rojo (50 % aproximadamente) es un factor a tener en cuenta al momento de recomendar el número óptimo de abejorros por hectárea que deberían ser llevados al cultivo para que la polinización sea eficiente.

A lo largo del período de estudio el tamaño de las colonias (luego de la instalación en el semillero) presentó variaciones que pueden ser explicadas por las tasas de nacimiento y muerte de las obreras. De todos modos, considerando globalmente la población de todas las colonias, no hubo variaciones importantes en el número de abejorros dentro de los nidos o en la proporción entre B. atratus y B. bellicosus.

Presencia de abejorros en el semillero

^{Varela y Rebuffo (1999}) encontraron que la producción de semillas de trébol rojo disminuía al aumentar la distancia a los nidos de abejorros, lo que sugiere la existencia de un gradiente de distribución de los insectos. En el presente estudio, el análisis de los datos tanto de las transectas como de las parcelas (medias ajustadas a las variables distancia y horario) no mostró un gradiente en la distribución de los abejorros desde la ubicación de los nidos al extremo opuesto del semillero como se esperaba. Sin embargo, no se puede descartar la existencia de tal gradiente en la distribución de los abejorros provenientes de las colonias experimentales, el cual pudo estar enmascarado por la presencia de abejorros provenientes de nidos naturales cercanos al semillero. La mayor concentración de B. atratus sobre el semillero se observó entre las 13.00 y 16.00 horas, mientras que la presencia de B. bellicosus se mantuvo sin cambios a lo largo del día. La elección de recursos a explotar en diferentes momentos del día está determinada principalmente por el suministro de néctar y polen de diversas especies botánicas disponibles en el radio de vuelo de los abejorros (^{Goulson, 2003}). La presencia de flora competitiva es un aspecto fundamental que condiciona la eficacia en la polinización entomófila de un cultivo (^{Peterson, Furgala y Holdaway, 1960}; ^{Palmer-Jones Forster y Clinch, 1966}; ^{Corbella et al., 1995}). En este estudio, se observó que durante la mañana los abejorros recolectaban una mayor proporción de polen de solanáceas ubicadas en las cercanías del semillero. Esto podría explicar la presencia reducida de B. atratus en el semillero de trébol rojo en ese momento del día.

Los registros de abejorros en las transectas indican que aunque no hubo un gradiente de distribución de un extremo al otro, los abejorros no se distribuyeron de manera homogénea en el semillero (Figura 2B). Su distribución estuvo determinada por la variación en la densidad de inflorescencias atractivas en distintas zonas del semillero (Figura 1 vs Figura 2E).

Otros insectos presentes en el semillero

La presencia significativa de mariposas de la familia Pieridae, especialmente Colias lesbia, en la primera mitad del período de estudio podría deberse a que los adultos de este grupo comúnmente aparecen de forma explosiva en ciertos momentos en cultivos de leguminosas, plantas de las cuales se alimentan sus larvas (^{Bentancour y Scatoni, 2006}). De acuerdo con ^{Free (1993}), únicamente las abejas melíferas, los abejorros y otras pocas especies de abejas solitarias son capaces de polinizar eficientemente el trébol rojo. La contribución de C. Lesbia a la polinización de trébol rojo durante sus visitas para alimentarse del néctar probablemente es irrelevante.

Llamativamente, las abejas melíferas fueron observadas en baja frecuencia en el semillero de trébol rojo a pesar de que a 700 m se encontraba un apiario de 25 colmenas y no había ningún otro cultivo importante de valor apícola en las inmediaciones. Aunque esta especie en ciertas condiciones es considerada un polinizador eficiente de trébol rojo, su baja frecuencia y dos aspectos de su comportamiento pecoreador observado en este estudio sugieren que su contribución en la producción de semillas seguramente no fue relevante. En primer lugar, se encontró que el número de flores visitadas por las abejas por unidad de tiempo es aproximadamente un tercio que el que vistan las dos especies de abejorros. En segundo lugar, se observó que muchas de las abejas acceden a la flor por el costado sin contactar las estructuras reproductivas y por tanto no aportarían en la polinización del cultivo (Sheena Salvarrey, datos no publicados). Los problemas de las abejas melíferas para polinizar el trébol rojo en Uruguay había sido verificada por ^{Formoso (2010}) quien no consiguió superar los 54 kg/ha de semillas aun utilizando 10 colmenas/ha. Un aspecto relevante en este sentido es la dificultad que tienen para acceder al néctar del trébol rojo debido a la profundidad de la corola de sus flores (^{McGregor, 1976}; ^{Corbella et al., 1995}). Esto último podría explicar la escasa presencia de abejas en el semillero de trébol rojo.

Rendimiento de semillasCuadro 1

En general, el análisis de rendimiento en la producción de semillas de trébol rojo se realiza a partir de cultivos en primera floración (^{Peterson, Furgala y Holdaway, 1960}). El presente estudio se llevó a cabo en un semillero de trébol rojo que se encontraba en su segunda floración, lo que explica por qué algunos valores de los componentes de rendimiento difirieron de los reportados en la literatura. Esto fue particularmente importante para aquellos indicadores que dependen del estado de la planta y de las condiciones ambientales, tales como el número de inflorescencias/m², el número de flores por inflorescencia y el peso de 1000 semillas (^{Formoso, 2010}). El número de inflorescencias/m² fue mucho menor que el reportado por ^{Formoso (2010)} para una primera floración (700 inflorescencias/m²). Por otro lado, el número de flores por inflorescencia fue mayor al máximo experimental reportado para Uruguay que es de 83 (^{Formoso, 2010}). Finalmente, el peso de 1000 semillas fue similar al reportado por ^{Formoso (2010)} (1,80 g). Sin embargo, este valor mayor al esperado para el momento analizado, podría ser producto de la intensidad del proceso de limpieza de semillas utilizado en el presente estudio. Se siguió un procedimiento comercial, seleccionando semillas bien desarrolladas y resultando por tanto en un peso de semillas sobrevaluado.

En relación a los tres indicadores mencionados previamente, el número de abejorros estuvo asociado significativamente solo con el número de inflorescencias/m². Esto refleja que la disponibilidad de recursos florales es lo que determinó la presencia de abejorros en las parcelas.

Por otro lado, para evaluar la habilidad polinizadora de los abejorros en el trébol rojo, los indicadores de rendimiento más relevantes son aquellos que resultan de la propia acción de los polinizadores tales como la proporción de semillas por flor de cada inflorescencia, el número de inflorescencias maduras/m² y parcialmente, con el peso de semillas/m².

La proporción promedio de semillas por inflorescencia fue superior a la reportada por ^{Formoso (2010}), quien determinó que el máximo rendimiento de cuajado podría alcanzar a 61,9 % utilizando abejas melíferas como polinizadores. Sin embargo, a diferencia de lo que podría esperarse, este indicador no pudo asociarse al número de abejorros presentes en las parcelas. Por otro lado, el número de inflorescencias maduras (con semillas)/m² sí se asoció positivamente con el número de abejorros, lo que refleja su acción como polinizadores. Como se mencionó previamente, los abejorros se distribuyeron en el semillero de acuerdo a la distribución de los recursos. En conjunto, estas observaciones sugieren que el número de flores polinizadas no dependió de la densidad de los abejorros, sino que la presencia de estos insectos que es la que determinó su polinización está condicionada por la cantidad de inflorescencias atractivas disponibles.

La relación encontrada entre el número de abejorros y el peso de las semillas por metro cuadrado probablemente refleje una mayor cantidad de semillas producidas por unidad de superficie. No se puede descartar que el peso individual de las semillas también sea mayor, pero no es posible establecer una comparación con datos bibliográficos debido a que el método utilizado selecciona las semillas más pesadas. Cualquiera sea el caso, el hecho de por cada dos abejorros detectados pecoreando, el rendimiento de semillas (medido en gramos por metro cuadrado) incrementó en una unidad, es información valorable a considerar cuando se utilizan abejorros como polinizadores en la producción comercial de semillas de trébol rojo.

Todo lo expuesto anteriormente, sugiere que para que se obtenga un buen rendimiento de semillas es más importante la relación entre el número de abejorros y el número de inflorescencias en el cultivo que la densidad absoluta de abejorros. Por lo tanto, el principal factor que habría limitado el rendimiento de semillas en el presente estudio sería el número de inflorescencias por unidad de superficie que, como se mencionó previamente, fue notoriamente menor que lo registrado en condiciones normales para la producción de semillas de trébol rojo (^{Formoso, 2010}). En concordancia con esto, ^{Varela y Rebuffo (1999}) encontraron que el rendimiento de semillas estaba asociado a la mayor densidad de inflorescencias. ^{Portella Montardo et al. (2003}) también encontraron que el rendimiento de semillas de trébol rojo estuvo correlacionado (r = 0,710) con el número de inflorescencias por planta.

En el presente estudio, el rendimiento de semilla promedio por hectárea fue de 74 kg, valor que está muy por debajo del promedio nacional. Las razones para este bajo rendimiento fueron principalmente debidas a la poca cantidad de inflorescencias/m² (condiciones climáticas) y a una cosecha anticipada. Esta cosecha anticipada afectó el número de inflorescencias maduras (74 % del total) pero principalmente el desarrollo de las semillas de las flores polinizadas. Semillas inmaduras o no bien desarrolladas fueron perdidas durante el proceso de limpieza. No obstante, si el rendimiento por hectárea se calcula utilizando los valores de los indicadores obtenidos en el presente estudio (106 flores por inflorescencia, 64,4 % de cuajado y 1,8 g de peso de 1000 semillas) pero con 700 inflorescencias/m² (correspondiente a un valor normal para una primera floración de trébol rojo), se obtendría un rendimiento de 836 kg/ha. Este valor hipotético es siete veces mayor al promedio nacional de producción de semillas de trébol rojo (119 kg/ha) reportado por ^{García et al. (1991}). Este valor también se destaca entre valores de rendimiento de semillas de trébol rojo reportados para otros países. Por ejemplo, en Polonia ^{Wilczek y Æwintal (2008}) encontraron valores de 688, 737 y 937 kg/ha en el cultivar Parada para años diferentes. En Serbia, ^{Tomiæ et al. (2014}) encontraron valores promedio para cuatro cultivares de trébol rojo de 251 kg/ha para un año lluvioso y 638 kg/ha para un año con menos lluvias.

Cuadro 1: Valores promedio, desvío estándard (DE) y rango de los indicadores de rendimiento para la producción de semillas de trébol rojo calculados en 25 parcelas experimentales