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Agrociencia (Uruguay)

Print version ISSN 1510-0839On-line version ISSN 2301-1548

Agrociencia Uruguay vol.21 no.1 Montevideo June 2017

 

Articles

Establecimiento in vitro de Yerba mate (Ilex paraguariensis A. St.-Hil.)nativa de Uruguay

In vitro Establishment of Native Yerba Mate (Ilex paraguariensis A. St.-Hil.)from Uruguay

Silvia Ross1 

María Emilia Arriaga1 

Evelin Pechi1 

1 Universidad de la República, Facultad de Agronomía, Departamento de Biología Vegetal, Laboratorio de FisiologíaVegetal. Correo electrónico: sross@fagro.edu.uy


Resumen:

La yerba mate (Ilex paraguariensis A. St.-Hil.) es una especie de gran importancia social y cultural en Uruguay, que presentadestacadas propiedades medicinales. Aunque en Uruguay no se planta a escala comercial, se encuentran poblacionesnaturales de esta especie, que son un importante reservorio de diversidad genética. La propagación de la yerba mate es unalimitante que debe ser resuelta para hacer posible cualquier actividad productiva o de conservación de este recurso genético.Las técnicas de cultivo in vitro permiten obtener un gran número de plantas relativamente uniformes a partir de poco materialinicial, resultando en una mayor ganancia genética. La etapa inicial de establecimiento in vitro es limitante para la clonación,ya que generalmente hay un elevado porcentaje de pérdidas debidas a contaminación y oxidación de los explantos. En estetrabajo se estudió la respuesta de materiales nativos de yerba mate procedentes de la Gruta de los Helechos (Tacuarembó),durante la etapa de establecimiento in vitro, comparándolos con un material comercial. Se evaluó el efecto de dos tiempos deinmersión en hipoclorito de sodio (15 y 20 minutos) y el efecto de adicionar nitrato de plata al medio de cultivo en dosconcentraciones (6 o 12 μM). El agregado de nitrato de plata en el medio de cultivo redujo la contaminación bacteriana y laoxidación de los explantos, independientemente de la concentración empleada. El 70 % de los explantos de I. paraguariensisnativa sobrevivió la etapa de establecimiento in vitro y presentó yemas axilares que desarrollaron brotes.

Palabras clave: contaminación; micropropagación; oxidación; nitrato de plata

Summary:

Yerba mate (Ilex paraguariensis A. St.-Hil.) is a species of great social and cultural importance in Uruguay, with outstandingmedicinal properties. Although there are no commercial plantations in Uruguay, there are natural populations that represent areservoir of genetic diversity for the species. The propagation of yerba mate is a limitation that must be solved to make posible any productive or conservationist activity of this genetic resource. In vitro culture techniques allow the production of a largenumber of relatively uniform plants from little starting plant material, resulting in a larger genetic gain. The initial stage of in vitro establishment is limiting for cloning, since there is generally a high percentage of losses due to contamination and oxidation ofthe explants. In this work the response of native yerba mate materials from Gruta de los Helechos (Tacuarembó, Uruguay)during the in vitro establishment stage was studied and compared with commercial plant material The effect of two immersiontimes in sodium hypochlorite (15 and 20 minutes) and the effect of adding silver nitrate to the culture medium in two concentrations(6 or 12 μM) were evaluated. The addition of silver nitrate to the culture medium reduced bacterial contamination andoxidation of the explants regardless of the concentration used. Seventy percent of the explants of native I. paraguariensissurvived the in vitro establishment stage and new shoots developed from axillary buds.

Keywords: contamination; micropropagation; oxidation; silver nitrate

Introducción

La yerba mate (Ilex paraguariensis A. St.-Hil.) es unaespecie perteneciente a la familia Aquifoliaceae, ampliamenteconsumida en infusiones en el sur de América Latina,donde tiene gran importancia social y cultural. Numerosaspublicaciones acerca de sus propiedades biomédicas yfarmacológicas demuestran su efecto antioxidante, vasodilatadory antimutagénico entre otros (Bracesco et al., 2011).Uruguay es reconocido como el principal país consumidorde la infusión, aunque no cuenta con cultivos comercialesen su territorio (RAU, 2000). La especie se distribuye naturalmenteen los bosques subtropicales del este de Paraguay,noreste de Argentina, sur de Brasil y Uruguay. EnUruguay, las poblaciones de yerba mate ocupan áreas derefugio de vegetación y alta riqueza específica, ubicadas enla zona este y noreste, representando el límite sur de distribuciónnatural de la especie (Grela y Brussa, 2003; Giberti,2011). Algunos autores indican que existe una gran distanciagenética entre las poblaciones uruguayas y las del restode su distribución natural presentando adaptaciones a ambientesque difieren sustancialmente de las áreas de produccióncomercial (Cascales et al., 2014), y constituyen unreservorio de variabilidad genética que puede resultar valiosoo incluso imprescindible para la selección de materialespromisorios para nuestras condiciones climáticas (Giberti,1995) a incluir en programas de mejoramiento y/o conservaciónde la especie.

Por tratarse de una especie alógama, la propagaciónvegetativa es una técnica de gran valor para la multiplicaciónde materiales selectos. Dicha práctica permitecaptar el componente aditivo y no aditivo de la varianzagenética, resultando en mayores ganancias dentro deuna misma generación de selección (Fielding, 1970).Asimismo, se obtiene mayor uniformidad de crecimiento,forma, características tecnológicas, y otras característicasdeseables, y es posible estandarizar la produccióny los usos del material vegetal. En otras especiesse ha demostrado que la capacidad de propagación estácontrolada genéticamente y que existe variabilidad enlas poblaciones naturales (Beyl y Trigiano, 2015). EnArgentina y Brasil, existen numerosos trabajos publicadosen los que se han evaluado diferentes alternativaspara propagar vegetativamente plantas de yerba mate(Salas Pino y Laviosa, 1998; Sansberro et al., 1999,2000; Sansberro, Mroginski y Bottini, 2000, 2001; Wendling,2004; Tarragó et al., 2005, 2012; Dolce y Rey,2006; Wendling et al., 2007, 2013; Dutra, Hansel y Wendling,2008; Horbach, 2008; Brondani et al., 2010; Dolce,Mroginski y Rey, 2010; Griebeler et al., 2014). Sin embargo,hasta el momento existen muy pocos estudiossobre las poblaciones silvestres de yerba mate uruguayas.El escaso conocimiento acerca de estos materiales,en particular de su capacidad de propagación, tantopor métodos vegetativos como a través de semillas, esuna limitante importante para el mejoramiento y uso degermoplasma de yerba mate nativo.

La micropropagación es una técnica que resulta de graninterés práctico ya que permite producir plantas a partir demateriales seleccionados, cuando la propagación por semillaes difícil y se cuenta con poco material vegetal inicial(Zaniolo y Zanette, 2001). Para poder desarrollar un sistemade micropropagación, es fundamental estudiar todoslos factores que inciden en la etapa de establecimiento invitro, que pueden ser limitantes del proceso, en particularcuando se trata de especies leñosas (Bernasconi et al.,1996). Las mayores pérdidas en esta etapa se deben a laoxidación y/o contaminación de los explantos (Dutra y Silva,2009). Generalmente, las especies leñosas presentanuna alta carga endógena y exógena de agentes patógenos,que no son completamente removidos con los tratamientosde desinfección empleados habitualmente y proliferan duranteel cultivo causando la muerte de los explantos. Laoxidación u oscurecimiento de los tejidos cultivados in vitroes causada por radicales libres que oxidan diferentes componentescelulares, así como por la oxidación de compuestosfenólicos para producir quinonas, especies químicas muyreactivas que generan daños que pueden llevar a la muertecelular (Azofeifa, 2009). Los compuestos fenólicos sesintetizan en respuesta al estrés que genera el corte y sonliberados al medio por las superficies cortadas. Algunosautores vinculan la oxidación con la acción del etileno,fitohormona gaseosa cuya biosíntesis es estimulada en condicionesde estrés (Liau et al., 1997; Ozden-Tokatli, Ozudogruy Akcin, 2005; Sarropoulou, Dimassi-theriou y Therios,2016) y que promueve la acumulación de diversos metabolitossecundarios en los recipientes de cultivo (George,Hall y de Klerk, 2008). Este proceso de oxidación se acentúacuando se emplean agentes desinfectantes en altas concentracioneso durante tiempos prolongados. Por eso resultaimprescindible ajustar tratamientos de desinfección quelogren disminuir la contaminación sin dañar la capacidad deregeneración del explanto (Hartmann y Kester, 1998). Elnivel de pérdidas en la etapa de establecimiento in vitroconstituye una de las principales limitantes para la micropropagación,especialmente cuando los explantos provienen de plantas leñosas creciendo a campo (Ramírez, León de Sierraltay Urdaneta, 1999).

El objetivo de este trabajo fue estudiar la sobrevivencia,durante la etapa de establecimiento in vitro, de materialesde yerba mate nativos de Uruguay, como primera etapapara el desarrollo de un método de propagación in vitro deárboles nativos maduros de esta especie. Se compara larespuesta obtenida con plantas de una población nativa dela Gruta de los Helechos, en el departamento de Tacuarembó(NE de Uruguay), y plantas de un material comercial deorigen policlonal, frente a distintos niveles de dos agentesdesinfectantes (hipoclorito de sodio y nitrato de plata).

Materiales y métodos

Material vegetal

Se cultivaron in vitro segmentos nodales con una o dosyemas axilares, obtenidos a partir de plantas madre de tresa cuatro años. Se utilizaron plantas madre obtenidas porsemilla, de dos procedencias: plantas nativas de la Grutade los Helechos (departamento de Tacuarembó, Uruguay)y plantas de una variedad comercial policlonal del InstitutoNacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) de Argentina.Los materiales fueron identificados como GH (procedenciaGruta de los Helechos) y C (procedencia comercial).

Las plantas madre se cultivaron en condiciones de invernaderodurante los tres meses previos a la instalacióndel ensayo, a una temperatura constante de 24 ± 2 ºC, yfueron podadas eliminando el brote apical para inducir labrotación de las yemas axilares.

Se realizaron aplicaciones foliares semanales de fungicida(Captan®, 0,2 %), fertilizante Phostrogen® [NPK(MgO3-SO3): 14-10-27(2,5-7.5)] y 8,8 mM Bencilaminopurina(BAP, Sigma B-3408; Sigma-Aldrich) (Sansberro, Mroginskiy Bottini, 2005), para obtener explantos vigorosos yreducir la carga de patógenos.

Se colectaron brotes de 8 a 10 cm de largo, los cualesinmediatamente de colectados fueron inmersos en una soluciónantioxidante de polivinilpirrolidona (PVP al 1 %) parasu traslado desde el invernáculo al laboratorio.

Tratamientos de desinfección

Los brotes se lavaron con agua corriente y detergentecomercial (Deterjane®), se quitaron las hojas y se cortaronsegmentos nodales con una o dos yemas axilares, de 1,0a 1,5 cm de largo. Estos explantos se sumergieron en unasolución de fungicida (Captan®, 0,5 %) durante 20 min, enagitación. En la cámara de flujo laminar se colocaron enuna solución de etanol 70 º durante un minuto y posteriormenteen una solución de hipoclorito de sodio (2 %). Seevaluó el efecto de dos tiempos de inmersión en la soluciónde hipoclorito de sodio: 15 y 25 minutos. Finalmente serealizaron dos enjuagues con agua destilada estéril y untercer enjuague con una solución de ácido cítrico (0,1 %).Los explantos permanecieron inmersos en la solución deácido cítrico hasta su siembra en el medio de cultivo.

Medio de cultivo

El medio de cultivo basal empleado fue MS (Murashigey Skoog, 1962) diluido cuatro veces (Rey et al., 1991),suplementado con vitaminas MS, sacarosa (3 %) y 0,44μM BAP (Sansberro et al., 2000). Como agente gelificantese empleó agar (0,6 %) (Sigma A-4550; Sigma-Aldrich, St.Louis MO, USA). Se ajustó el pH en 5,80 previo al autoclavadoa 121 ºC durante 20 min. Se evaluó el efecto de agregaral medio nitrato de plata (AgNO3) como agente desinfectante,en dos concentraciones: 6 y 12 μM.

Condiciones de cultivo

Los cultivos se incubaron en cámara de crecimiento auna temperatura de 24 ± 2 ºC, 30 μmol de fotones m-2 s-1 deirradiancia y fotoperíodo 16:8; horas de luz y oscuridadrespectivamente.

Diseño experimental y análisis estadístico

Se empleó un diseño factorial 2 x 2 x 3, completamentealeatorizado, con dos materiales vegetales (comercial ynativo), dos tiempos de desinfección en hipoclorito de sodioal 2 % (15 y 25 minutos), y tres niveles de nitrato de plataagregado al medio de cultivo (0; 6 y 12 μM). Se realizaroncinco repeticiones por tratamiento, empleando 10 explantospor repetición, para cada combinación de factores.

Durante 30 días se evaluó semanalmente la presenciade contaminación (hongo o bacteria), el número de explantosoxidados y la sobrevivencia, considerada como explantosque brotaron y que no presentaron síntomas deoxidación ni contaminación.

Se realizó el análisis de varianza y posterior comparaciónde medias (LSD) empleando el software estadísticoInfoStat®, versión 2009 (Universidad Nacional de Córdoba,Argentina), de acuerdo con el siguiente modelo:

Resultados y discusión

Ninguno de los dos materiales evaluados mostró diferenciassignificativas en el porcentaje de sobrevivencia invitro (p = 0,9240). Sin embargo, las diferencias encontradasentre materiales en el porcentaje de oxidación y contaminaciónbacteriana sí fueron significativas. El nitrato de platatuvo efecto significativo en el control de la contaminaciónbacteriana (p < 0,0001), la oxidación (p < 0,0001) y la sobrevivenciade los explantos (p < 0,0001) en la etapa deintroducción in vitro, pero no tuvo efecto en reducir la contaminaciónfúngica (p = 0,0876). No se encontraron diferenciassignificativas entre los dos tiempos de inmersión enhipoclorito de sodio evaluados para las variables analizadas

(Cuadro 1).

Cuadro 1 Resumen del ANAVA para las variables contaminación con hongo y bacteria, oxidación y sobrevivenciade explantos de Ilex paraguariensis en la etapa de establecimiento in vitro. NaOCl: hipoclorito de sodio; AgNO3:nitrato de plata; gl: grados de libertad, CV: coeficiente de variación 

Efecto del material vegetal

Ambos materiales (C y GH) mostraron un porcentaje desobrevivencia similar, superando el 50 % en la etapa deestablecimiento in vitro. Sin embargo, se observaron diferenciassignificativas en la contaminación (p < 0,0001) yoxidación (p < 0,0001) de los explantos según el materialvegetal. El material comercial (C), presentó un nivel de contaminaciónmenor a 10 % (tanto por hongo como por bacteria)pero las pérdidas por oxidación fueron importantes(cercanas al 25 %) y mayores a las observadas en elmaterial de origen nativo (próximas al 2 %). Por otro lado, elmaterial nativo (GH) mostró un alto porcentaje de contaminaciónbacteriana cuando no se agregó nitrato de plata almedio (35 %) y no mostró diferencias de contaminaciónfúngica respecto al material comercial con ninguno de lostratamientos evaluados (Figura 1).

Figura 1 Sobrevivencia, oxidación y contaminación (con bacteria y hongo) de explantos de I. paraguariensisen la etapa de introducción in vitro. Se muestran los promedios por genotipo: C (material comercial), GH(material nativo procedente de la Gruta de los Helechos, Tacuarembó) 

El material comercial se comportó de acuerdo a lo esperadopara materiales seleccionados, provenientes de unprograma de mejoramiento y cultivados en condicionescontroladas, presentando bajos niveles de contaminaciónpor hongo y/o bacteria. Por otro lado, era esperable que elmaterial nativo presentara mayor carga de contaminantes,tanto fúngicos como bacterianos, por tratarse de plántulassin ningún tipo de manejo previo a su llegada al invernáculo.Sin embargo, la contaminación fúngica fue baja (3,5 %) y nomostró diferencias significativas con el material comercial,posiblemente por efecto del pretratamiento con fungicidaaplicado a las plantas madre. La contaminación bacterianade origen endógeno es de más difícil erradicación y semanifestó cuando se cultivaron los explantos in vitro, en unmedio rico en nutrientes y azúcar. Trabajos anteriores conyerba mate citan tasas de contaminación superiores al90 % en esta etapa, empleando hipoclorito de sodio (1 %)durante 10 minutos (Dutra y Silva, 2009), e indican que lacontaminación de origen endógeno es una de las principalescausas de pérdida de explantos en la etapa de establecimientoin vitro de la especie (Bernasconi et al., 1996).

El diferente porcentaje de oxidación que mostraron losmateriales evaluados puede estar dado por una diferentecapacidad de síntesis o por una sensibilidad diferente a losefectos del etileno y los compuestos fenólicos que se originanfrente a la condición de estrés generada por el corte, alseparar los explantos de la planta madre (Azofeifa, 2009).Las especies que naturalmente contienen altos niveles detaninos como la yerba mate (Vieira et al., 2010) presentanmayor susceptibilidad a lo oxidación durante el cultivo invitro (George, Hall y de Klerk, 2008). Sin embargo, la oxidacióndel tejido es muy dependiente del genotipo, en particularde los propios niveles endógenos de compuestosfenólicos de cada material, así como de su toxicidad, ymuchas veces se encuentran diferencias entre especiesdel mismo género y también entre cultivares de una mismaespecie (Azofeifa, 2009). En varias especies, cuando lasplantas madre crecen en oscuridad o con baja intensidadlumínica, se reducen los niveles de oxidación in vitro, yaque disminuye la actividad de las enzimas relacionadascon la biosíntesis y oxidación de los compuestos fenólicos(George, Hall y de Klerk, 2008). Si bien las plantas madredel material GH estaban creciendo en invernáculo en lasmismas condiciones que el material comercial (C), procedíande la regeneración natural dentro del monte, creciendoen condiciones de baja intensidad lumínica, y esto puedeexplicar los menores niveles de oxidación observados,además de las diferencias genéticas.

Efecto del nitrato de plata

El agregado de nitrato de plata en el medio de cultivoaumentó de manera significativa el promedio de sobrevivenciade ambos materiales vegetales en esta etapa, lográndosemás de 70 % de explantos sobrevivientes, quedesarrollaron yemas axilares vigorosas (Figura 2). Sinembargo, no se encontraron diferencias entre las dos concentracionesde nitrato de plata evaluadas para ninguna delas variables estudiadas. La contaminación bacteriana y laoxidación de los explantos se redujeron significativamentecuando el nitrato de plata estaba presente en el medio, independientementede la concentración empleada (6 o 12 μM),resultando en mayores tasas de sobrevivencia. Sin embargo,en Pistacia vera (Ozden-okatli, Ozudogru y Akcin,2005) y Solanum tuberosum (Alva Ticona y Oropeza, 2013)está reportado que concentraciones superiores a 12 μMinhiben la proliferación de brotes in vitro. En otras especies(Colobanthus quitensis, Sinningia speciosa) se hanobtenido resultados similares con el agregado de plataen forma de tiosulfato, el cual promueve la brotación deyemas axilares in vitro favoreciendo la regeneración(Cuba-Díaz et al., 2014).

Figura 2 Brotación de yemas axilares de yerba mate nativa (GH), en la etapa de establecimiento in vitro, en medio MS diluido cuatro veces y en presencia de AgNO3 6 μM. 

Otros autores indican que el ion plata puede ser efectivocomo agente antifúngico (Jo, Kim y Jung, 2009;Kim et al., 2012). Sin embargo, nuestros resultadosno mostraron ningún efecto del agregado de nitrato deplata en reducir la contaminación fúngica en explantosde I. paraguariensis.

El efecto del nitrato de plata en reducir la contaminaciónbacteriana y la oxidación fue diferente según el genotipo(Figuras 3 y 4).

Figura 3 Efecto del nitrato de plata (0, 6 y 12 μM AgNO3) en el porcentaje de contaminación (con bacteria yhongo), oxidación y sobrevivencia de explantos de material comercial (C) de I. paraguariensis cultivados invitro. 

Figura 4 Efecto del nitrato de plata (0, 6 y 12 μMAgNO3) en el porcentaje de contaminación (con bacteria yhongo), oxidación y sobrevivencia de explantos de material nativo (GH) de I. paraguariensis cultivados in vitro. 

Oxidación

El material comercial, no presentó una contaminaciónimportante, pero sí una alta sensibilidad a la oxidación.En este material, el nitrato de plata redujo el efectode los compuestos fenólicos de manera muy significativamejorando la sobrevivencia de explantos (Figura 3).El ion plata es un potente antagonista capaz de inhibir unamplio rango de respuestas inducidas por el etileno (Gohet al., 1997). Esto puede explicarse por su efecto inhibidorde la acción del etileno, compitiendo por los receptoresde esta hormona y disminuyendo la síntesis demetabolitos secundarios (George, Hall y de Klerk, 2008).Resultados similares se han encontrado en otras especiesleñosas de los géneros Pistacia (Ozden-Tokatli,Ozudogru y Akcin, 2005), Garcinia (Goh et al., 1997) yPrunus (Sarropoulou, Dimassi-theriou y Therios, 2016)empleando nitrato o tiosulfato de plata como inhibidorescompetitivos del etileno, o inhibidores de su síntesis,como la aminoetoxivinilglicina (AVG). El empleo de otrosagentes antioxidantes agregados al medio de cultivo,como carbono activado y L-cisteína no fue efectivo enreducir la oxidación de explantos de yerba mate cultivadosin vitro (Mroginski et al., 1997).

Contaminación

El material nativo presentó una contaminación bacterianamayor al 70 %. Fueron identificadas colonias debacilos Gram positivos y Gram negativos (resultadosno mostrados). El agregado de nitrato de plata redujo demanera significativa la presencia de bacterias, independientementede la concentración empleada (6 o 12 μM)(Figura 4). Otros autores lograron un efectivo control dela contaminación bacteriana en I. paraguariensis e I.dumosa mediante el empleo de antibióticos o agentesbiocidas (Luna et al., 2009, 2013).

Con el agregado de nitrato de plata (6 μM) puedeevitarse el empleo de antibióticos, los cuales tienen solamenteun efecto bacteriostático y además, por su altaespecificidad, generalmente no previenen la proliferaciónde todos los microrganismos in vitro. Por otro lado,los antibióticos modifican la composición del medio decultivo y pueden ser metabolizados por los explantos,por lo cual sólo deberían emplearse en casos excepcionales(Roca y Mroginski, 1991). El ion plata es altamentetóxico para varios microorganismos, entre los que seencuentran varias especies de bacterias, aunque aúnno se conoce exactamente el modo de acción. Se hapropuesto que su fuerte efecto inhibitorio y bactericidapuede estar explicado por la interacción de este ion convarias enzimas vitales, inactivándolas y también por loscambios que causa en la permeabilidad de las membranas,causando la muerte celular (Prabhu y Poulose, 2012).

Conclusiones

Fue posible establecer in vitro segmentos nodales dematerial de yerba mate nativo de Uruguay, obteniendo porcentajesde sobrevivencia superiores al 50 %. La incorporaciónde nitrato de plata al medio de cultivo resultó efectivapara reducir la contaminación bacteriana, sin necesidad deincorporar antibióticos al medio de cultivo. Asimismo, elagregado de esta sal resultó en una disminución de síntomasde estrés probablemente causados por la acumulaciónde etileno en el recipiente de cultivo.

Generalmente, un único método no es suficiente paracontrolar la oxidación de los explantos en la etapa de introducción,ya que es un problema complejo, regulado pormúltiples factores. Sin embargo, el empleo de nitrato deplata 6 μM en el medio de cultivo fue suficiente para reducircompletamente la oxidación de los explantos de ambosmateriales vegetales (comercial y nativo), por lo tanto enyerba mate se pudo superar esta limitante incluyendo estasal en el medio de cultivo.

Agradecimientos

Agradecemos al Ing. Agr. Andrés Berruti por su colaboraciónen la colecta de las plantas madre provenientes de laGruta de los Helechos (departamento de Tacuarembó) y alos organizadores del VI Congreso Sudamericano de Yerbamate y II Simposio Sudamericano de Yerba mate ysalud, en la persona del Dr. Nelson Bracesco, por proporcionarnoslos ejemplares de yerba mate comercial empleadosen este estudio.

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Recibido: 10 de Noviembre de 2016; Aprobado: 08 de Mayo de 2017

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