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Introducción
La variedad Vitis vinifera L. cv Tannat, introducida en Uruguay en el siglo XIX y adaptada a los suelos y clima del país, es la variedad tinta con mayor implantación: ocupando en la actualidad casi el 25 % de la superficie total de viñedos 1.
En general, los vinos obtenidos a partir de esta variedad presentan elevados contenidos de polifenoles totales, antocianos, catequinas y proantocianidinas, una intensidad colorante superior y mayores tonalidades rojas que los vinos elaborados a partir de Cabernet Sauvignon y Merlot 2-5.
Los polifenoles presentan valores medios de 2 g/L, de los cuales 65-70% son polifenoles neutros (catequinas y epicatequinas) y aproximadamente 15%, corresponde a quercetina y mircetina. La fracción restante estaría integrada por los ácidos gálico y cafeico, todos ellos con una potente acción antioxidante 6,7.
El consumo de vino tinto se asocia con la disminución del riesgo coronario y prevención de enfermedades crónicas vinculadas al estrés oxidativo (arterioesclerosis, artritis, demencia, cáncer). Las propiedades beneficiosas del vino se relacionan con su capacidad antioxidante por su alto contenido de compuestos fenólicos. Se ha demostrado que algunos compuestos fenólicos presentes en el vino, como el resveratrol, ácido gálico y quercetina, tienen actividades contra alergias, inflamación, hipertensión, artritis y carcinógenos 8-10.
Los vinos tintos elaborados a partir de la variedad Tannat poseen un alto contenido de taninos y color intenso, características que son responsables de la originalidad de estos vinos 11,12 (Tabla 1, Figura 1). La caracterización química y polifenólica del vino Tannat, muestra un alto contenido de proantocianidinas conjugadas con ácido gálico 5, comparado con otras variedades tintas. Algunos trabajos sostienen que estos taninos tienen una actividad antioxidante mayor que los taninos no conjugados con ácido gálico 13 y, mediante estudios epidemiológicos, se asocian con regiones de poblaciones longevas.
Tabla 1. Contenido total de pigmentos (expresado en mg de malvidin-3-glucósido por litro de vino) y porcentajes de las principales familias de pigmentos encontradas en Tannat. 11
En otros trabajos se indica la capacidad antioxidante in vitro de estos vinos, en modelos de membranas celulares de cerebro de rata 14 y utilizando plasma humano, se observó que el vino Tannat inhibe in vitro la oxidación de la LDL humana producida por tres sistemas diferentes: inducción por Cu2+, peroxinitrito y lipoperoxidasa 15,16.
En estudios in vivo, se obtuvieron resultados que muestran una disminución significativa de las dobles roturas de ADN (DSB) inducidas por el peróxido de hidrógeno en presencia de vino Tannat y un aumento de la sobrevida celular, pudiéndose interpretar estos resultados sobre la base de dos mecanismos no excluyentes: protección de blancos críticos involucrados en las cascadas redox a nivel intracelular y estímulo de la reparación de ADN 17.
El efecto protector del vino Tannat podría darse a distintos niveles por su capacidad de reducir o de captar las especies reactivas del oxígeno. Los radicales hidroxilos generados por la reacción de Haber-Weiss (a partir de H2O2, O2- y Fe3+) podrían ser parte de un proceso general de óxido-reducción, donde el activador transcripcional Yap1 -en humanos AP (Jun-Fos)-, la tiorredoxina, el NADPH, el GSH. En nuestro caso, derivados fenólicos contenidos en el vino Tannat, podrían actuar manteniendo cierto estado de óxido-reducción protegiendo blancos críticos (ej. ADN nuclear, membrana mitocondrial, enzimas de reparación) involucrados en la muerte celular y en la inestabilidad genómica por lesiones oxidativas 18,19.
El ácido tánico (AT), es un compuesto polifenólico de bajo peso molecular que forma parte de los taninos hidrolizables. Estos compuestos son moléculas polihidroxiladas (polifenoles) que forman complejos insolubles con proteínas y polisacáridos y su acción es responsable de la astringencia de los alimentos ricos en taninos 20.
Se ha reportado que el tratamiento con AT en tejidos cerebrales de rata reduce estadísticamente los niveles de malondialdehído en un grupo que recibió glutamato monosódico y AT en comparación con los valores correspondientes del grupo de control 21. A su vez, las actividades de superoxodismutasa (SOD) en hemolizados de sangre del grupo tratado con glutamato monosódico y AT aumentan en comparación con los valores correspondientes para el grupo sólo tratado con glutamato monosódico. Adicionalmente, el pretratamiento con AT reduce los niveles de glucosa en sangre de los animales en comparación con los niveles del grupo tratado con glutamato monosódico como único agente. Estos resultados muestran que el pretratamiento con AT en ratas adultas disminuye los niveles de glucosa en sangre y el estrés oxidativo 21.
Otro estudio sugiere que el ácido tánico modula las vías de transductores de señales y activadores de la transcripción como EGF-R/Jak2/STAT1/3 y P38/STAT1/p21Waf1/Cip1 induciendo la detención del ciclo en G1 y la apoptosis intrínseca en carcinomas de mama 21,22.
También se observó una disminución en la frecuencia de revertantes inducidos por N-metil-N-nitrosourea (MNU) y N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) en la cepa TA100 de Salmonella typhimurium en presencia de los ácidos gálico y tánico 23.
Otros autores observaron que el AT entre otros taninos mejoraron la resistencia de linfocitos a las roturas de la cadena de ADN inducidas por mutágenos de alimentos y H2O2 in vitro 24. También en matrices alimentarias se demostró que el AT es un componente antioxidante natural eficaz que puede ser utilizado como agente conservante de alimentos o nutracéuticos 25.
Ciertos agentes físicos como las radiaciones ionizantes (RI) pueden alterar la proliferación celular, fundamentalmente por sus efectos sobre el ADN, membranas y componentes de cascadas de transducción de señales, lo que resulta en retardos en el ciclo celular, lesiones letales (necrosis, apoptosis), mutagénicas y recombinogénicas 26. Los daños moleculares son provocados principalmente por las reacciones de óxido-reducción de los radicales libres o especies reactivas de oxígeno y nitrógeno. Estos daños son el sustrato de enzimas de reparación y/o mecanismos de remoción de radicales libres 27.
A partir de estos antecedentes, la hipótesis que se plantea implica que ciertos compuestos presentes en el vino Tannat, aislados o en combinación, actúan como radioprotectores a nivel celular y molecular. Por lo tanto, en el presente trabajo se presentan los resultados del estudio sobre el daño producido por radiaciones ionizantes y la inducción de eventos potencialmente letales y mutagénicos en poblaciones celulares, así como su posible disminución en presencia de vino Tannat o componentes de este como el ácido tánico.
Materiales y métodos.
Cepa de levadura y condiciones de crecimiento: Se utilizaron poblaciones celulares de levaduras de la cepa haploide SC7K lys2-3, cultivadas en medio nutriente líquido YPD (1% extracto de levadura, 2% peptona y 2% dextrosa) a 30ºC y bajo agitación continua hasta alcanzar la fase exponencial de crecimiento (N=1x107 cel/mL).
Agente físico.
Gamma cell: Nordion 220, tasa de dosis 13,4 KGy/h. Se realizó la dosimetría con un dosímetro de polimetil metacrilato Harwell Amber S 3042.
Agentes Naturales.
-Vino Tinto Vitis vinífera cv. Tannat (VT). Se ha demostrado, para los vinos de la variedad Tannat, que el proceso de envejecimiento estabiliza los cambios producidos en las principales familias de pigmentos (antocianinas, piranoantocianinas, productos de condensación flavanol-antocianina directa y mediada por acetaldehído) 28. En consecuencia, se utilizaron muestras de vino tinto Tannat de la Región Cerro Chapeu, cosechado en 1997 (Lote L10832289) elaborado por Bodegas Carrau.
-Ácido tánico: 600 μg/mL (Merck, Darmstadt, Germany).
Tratamientos
Tratamientos simples y combinados.
A partir de los resultados obtenidos en curvas dosis-efecto de rayos gamma (50, 100 y 200 Gy), realizadas en nuestro laboratorio y considerando resultados publicados con dosis menores que no mostraron diferencias significativas; se seleccionó la dosis de radiación gamma de 200 Gy para los tratamientos simples y combinados (Tabla 2, Figura 2). 29,30
Tabla 2. Muestra la fracción de sobrevida (S(x)) en función de dosis crecientes de radiación y sus correspondientes intervalos de confianza. 30
Figura 2: Curva dosis efecto: Fracción de sobrevida (S(x)) a diferentes dosis de rayos gamma (50, 100 y 200 GY). (30)
Se partió de cultivos en fase exponencial de crecimiento con (N=1.2 x 107 cel/mL) los que fueron divididos en varios frascos y sometidos a tratamientos simples y sus combinaciones.
Tratamientos simples (un solo agente): rayos gamma dosis absorbida 200 Gy; AT 600 μg/mL (10% v/v); vino Tannat (10% v/v) y un respectivo control no tratado.
Tratamientos combinados (2 agentes): diez minutos previos a la irradiación se trataron las alícuotas de células en medio nutriente con: AT y vino Tannat a las concentraciones antes señaladas para luego someterlas a una dosis de radiación gamma de 200 Gy. Las fracciones celulares tratadas, pero no irradiadas, y la fracción sin ningún tratamiento se utilizaron como controles paralelos.
Sobrevida y Mutagénesis: Para el estudio de los efectos letales se determinó la sobrevida a los distintos tratamientos en medio nutriente YPDA (YPD + 2% agar) y se calculó la fracción sobreviviente según:
S(x,y) = Ns/No
donde, Ns: número de células sobrevivientes capaces de generar clonas por mL; No: número total de células tratadas por mL; x: dosis absorbida de rayos gamma, y: dosis de los productos naturales 29,31.
Para determinar la frecuencia mutagénica, las muestras de poblaciones celulares de levaduras, cepa SC7K lys2-3, con una concentración de 108 cel/mL se sembraron en placas de Petri (200 µL) conteniendo medio de selección OM (dextrosa 2%, base nitrogenada de levadura 0.67%, agar 2%) realizándose el ensayo por quintuplicado 29,32. Las placas se incubaron a 30°C durante 21 días y luego se realizó el conteo de las colonias correspondientes a las revertantes de auxotrofía a prototrofía lys → LYS 33,34.
Se calculó la frecuencia de mutación M(x,y) para cada dosis y sus combinaciones según
M(x,y) = Nm/Ns
siendo :
Métodos estadísticos
El análisis estadístico de los resultados obtenidos para la fracción de sobrevida se realizó según la distribución binomial, considerando resultados significativos para p<0.05. Para el análisis de frecuencia mutagénica se utilizó la distribución de Poisson.
Resultados
Con respecto a la fracción de sobrevida no se observó variación de las muestras tratadas con los agentes naturales como único agente en comparación con la muestra control.
En poblaciones tratadas simultáneamente con VT y rayos gamma (Rγ) así como con AT y Rγ se observó un aumento significativo en la probabilidad de sobrevida (0.33 ± 0.03 y 0.30 ± 0.03 respectivamen) comparada con la misma dosis de Rγ actuando como único agente. (Tabla 3, Figura 3).
Tabla 3. Muestra la Fracción de sobrevida (S(x)) con sus correspondientes intervalos de confianza en tratamientos simples: Vino tinto (VT) y ácido tánico (AT) y combinados: Radiación Gamma y Vino tinto (γ+VT) y Radiación Gamma y acido tánico (γ+AT).
Figura 3: Diagrama de barras donde se representa la fracción de sobrevida (S(x)) con sus correspondientes intervalos de confianza en control y muestras tratadas con diferentes agentes. C: control; VT: vino tinto; AT: ácido tánico; G: Radiación gamma.
Con relación a la frecuencia mutagénica, no se observaron diferencias significativas de la frecuencia mutagénica de los controles VT y AT con respecto a la frecuencia de mutación espontánea.
En las poblaciones tratadas con Rγ (200 Gy) como único agente, se observó un aumento significativo de la probabilidad de mutagénesis 12 veces mayor que la frecuencia espontánea.
Por otra parte, en las poblaciones tratadas simultáneamente con Rγ y VT, así como con Rγ y AT, se observó que la frecuencia mutagénica fue significativamente menor con respecto a las tratadas con Rγ como único agente (33%, 45% respectivamente) (Tabla 4, Figura 4).
Tabla 4. Muestra la Frecuencia mutagénica (FM) con sus correspondientes intervalos de confianza en tratamientos simples: Vino tinto (VT) y ácido tánico (AT) y combinados: Radiación Gamma y Vino tinto (γ+VT) y Radiación Gamma y acido tánico (γ+AT).
Discusión
De acuerdo a los objetivos planteados, se estudió el posible efecto protector frente a la radiación ionizante gamma de un producto natural y uno de sus componentes: el vino tinto (derivado de la Vitis vinífera Cv. Tannat: Vt) y acido tánico. Se estimaron las probabilidades de sobrevida y el potencial mutagénico de los distintos agentes. Para la definición de la dosis de radiación gamma fue utilizada curva y tabla de datos obtenidas en nuestro laboratorio (Tabla 2 y Figura 2) 30. Este punto si bien puede ser considerado una debilidad desde el punto de vista metodológico se basa en la existencia de publicaciones con dosis subletales que no mostraron diferencias significativas con la utilizada en este trabajo 29,30.
Cuando se analizaron los tratamientos combinados (ver Materiales y Métodos), se observó un aumento en la probabilidad de sobrevida en comparación con los tratamientos con rayos gamma como único agente (Figura 3), este dato podría indicar la existencia de uno o más mecanismos de defensa celular, ya sea por la capacidad antioxidante, de atrapamiento de radicales libres, y/o por acción indirecta sobre las vías de reparación del ADN de algún o algunos componentes presentes en los productos utilizados. Estos resultados van en línea con otros obtenidos en nuestro laboratorio y con resultados publicados por otros autores 15,16,17.
En relación a la probabilidad de mutación, la exposición de las poblaciones celulares a radiación gamma (200 Gy), resultó en un aumento con respecto a la frecuencia mutagénica espontánea y estas modificaciones o lesiones moleculares se evidenciarían al disminuir la capacidad de defensa antioxidante a distintos niveles y en distintos blancos moleculares. Se expresarían entonces los sistemas de reparación con error, ya sea de recombinación no homóloga y/o postreplicativa, de bases mal apareadas, ambas interrelacionadas y dependientes de la ubiquitinación de histonas (gen RAD6).
En conjunto, estos resultados del estudio de la protección por ácido tánico y vino Tannat sumado a datos proporcionados por la bibliografía nos permiten plantear, la posible existencia de uno o más componentes del vino Tannat actuando solos o interactuando con otras moléculas para contrarrestar los efectos potencialmente letales y mutagénicos de la radiación gamma. Estos componentes con alta probabilidad serían polifenoles como el ácido tánico, el resveratrol, la rutina, y vitaminas como la nicotinamida, actuando como protectores a nivel del ADN y de otros blancos involucrados en la reparación y protección del ADN, ya sea por sus efectos antioxidantes, de atrapamiento de radicales y/o por modulación de mecanismos en red de muerte celular y mutagénesis. Frente al estrés oxidativo diferentes tipos de vías de reparación del ADN (ej. escisional, recombinacional y postrreplicativa) podrían ser activadas (daño oxidativo del ADN, genes de respuesta al daño en el ADN).
La radioprotección presentada por los compuestos estudiados, podría explicarse entonces por interacciones de los polifenoles con cascadas de óxido-reducción perturbadas por la radiación gamma a nivel de los compartimientos extracelular e intracelulares (mitocondrias, núcleo), además de activación por cascadas de señalización redox de puntos nodales de control del ciclo celular los que interactúan modulando recombinación homóloga y unión de extremos no homólogos (HR y NHEJ) que determinan la reparación genómica sobre roturas simples y dobles del ADN (ej. Mec1/Tel1/hATR,hATM) 17,30,37,38. En caso de daño oxidativo a nivel de bases actúan además los sistemas de reparación BER (reparación por escisión de bases), MMR (reparación de bases mal apareadas) y postreplicativo que pueden modularse por mecanismos redox 39. Los resultados se interpretaron en base al modelo de óxido reducción polivalente de Wilson 40, donde los polifenoles interactúan junto con grupos sulfhídrilo (ej.: tioles de la cisteína y glutatión) como interruptores de las cascadas de óxido reducción a nivel intracelular y extracelular. En este contexto también el etanol a las concentraciones presentes en VT podría actuar como un factor de defensa celular 41.
En suma, se trata de un trabajo que indica el comienzo de una investigación donde se deberá analizar cada componente de estos productos naturales por separado y estudiar su posible efecto sinérgico o antagónico para determinar su rol como posible radioprotector.
Conclusión
Los resultados preliminares que se reportan en este trabajo podrían indicar que los vinos de la variedad Vitis vinífera cv Tannat y el ácido tánico poseen efectos protectores y radioprotectores en las condiciones experimentales utilizadas.
Este efecto protector podría explicarse por la presencia de compuestos capaces de producir interacciones de tipo redox. La interacción entre el ácido tánico y polifenoles contenidos en el vino, con los radicales libres formados por las radiaciones ionizantes podrían además activar cascadas de transducción a nivel de vías de reparación genómica y control del ciclo celular.
La protección contra el daño producido por las radiaciones ionizantes sobre el ADN y los sistemas de reparación involucrados en el procesamiento del mismo son temas importantes con respecto a la salud humana. Es así que sería de interés continuar con más investigaciones para poder esclarecer los mecanismos por los cuales el vino Tannat y el ácido tánico presentan efecto radioprotector.
