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Introducción
En Uruguay la intensificación de los sistemas de producción láctea, han conducido a un aumento en la cantidad y variedad de los alimentos destinados a cubrir las necesidades energéticas de las vacas en producción (Cajarville et al., 2012). Actualmente, los suplementos energéticos ocupan un 60% de la alimentación de los bovinos lecheros y el 40% restante es en base a pastoreo (INALE, 2014). Son las reservas forrajeras (henos y ensilados), los concentrados energéticos (granos de cereales) y los proteicos (harinas de oleaginosas), sustratos ideales para el crecimiento de hongos toxicogénicos (Ellis et al., 1991; Yiannikouris y Jouany, 2002). Entre estos hongos, los géneros Fusarium, Aspergillus y Penicillium son los más frecuentes en este tipo de alimentos (Pittet, 1998). La importancia de estos géneros, está dada por su capacidad de producir micotoxinas, metabolitos secundarios que consumidos con alimentos afectan la salud del hombre y animales (Swanson, 1987). Sumado al riesgo en salud pública, las micotoxinas provocan serios perjuicios económicos, afectando la calidad y cantidad de las cosechas. Iqbal et al. (2013) estiman que el 25% de granos de cereales y oleaginosas en el mundo están contaminados con micotoxinas. Tanto el desarrollo de estos hongos, como la producción de micotoxinas, se asocian a factores ambientales, principalmente temperatura y humedad (Coulombe, 1993).
En la actualidad se conocen más de 250 micotoxinas, siendo las más importantes para el ganado bovino las aflatoxinas, fumonisinas, tricotecenos, ocratoxina A y zearalenona (Gallo et al., 2015). A su vez, son las aflatoxinas (AF) las de mayor relevancia en salud pública, ya que, la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) clasifica la aflatoxina B1 (AFB1) como carcinogénica, perteneciente al Grupo IA (IARC, 2002). En adición a este efecto, es conocido que las AF consumidas por los animales, son metabolizadas y excretadas en parte como aflatoxina M1 (AFM1) a través de la leche (Galvano et al. 1998). Éste alimento representa entonces un riesgo potencial para humanos debido a que AFM1 es resistente a procesos térmicos y de pasteurización (Galvano et al., 1996). Esta micotoxina es clasificada en el grupo 2B como posible micotoxina carcinogénica para el hombre (IARC, 2012).
La fuente de AF para los animales, son los alimentos, por ello los niveles máximos están reglamentados en diversas regiones del mundo. La Unión Europea, establece el límite en 5 µg/kg de AFB1 en alimentos destinados a vacas lecheras. En Uruguay, la Dirección General de Servicios Agrícolas del Ministerio de Ganadería Agricultura y Pesca, recomienda un límite máximo de AF de 20 µg/kg en alimentos destinados a vacas lecheras en producción, de acuerdo a la reglamentación vigente del MERCOSUR. En Brasil a través del Compêndio Brasileiro de Alimentacão Animal (Sindirações, 2009), se establecen los mismos valores como límites máximos. En cuanto a la AFM1, Uruguay se rige por el reglamento del MERCOSUR (2002), donde el límite para consumo humano es de 0,5 µg/L para leche fluida, el mismo nivel establece Brasil a través de la Agencia Nacional de Vigilancia Sanitaria (ANVISA, 2002). La Unión Europea establece un límite inferior, 0,05 µg/L de AFM1 para leche fluida (Reglamento (EU) N° 165/2010, 2010). Debido a la contaminación con AF en los alimentos destinados a los animales y su posterior excreción por leche, es fundamental el control a lo largo de la cadena agroalimentaria láctea. En este sentido, el objetivo del presente estudio fue evaluar en establecimientos lecheros comerciales de las zonas centro-sur y este del Uruguay, la presencia natural de AF en los alimentos destinados a vacas lecheras en producción y de AFM1 en la leche de los animales que consumían esos alimentos.
Materiales y métodos
Colección de muestras
Se colectaron muestras de 18 establecimientos lecheros comerciales remitentes, seleccionados aleatoriamente de predios menores a 50 hectáreas, ubicados en los departamentos de Canelones, Lavalleja y San José. De cada establecimiento se retiró una muestra de 250 mL de leche del tanque de frío (n= 18) y una muestra de 2 kg por cada uno de los suplementos alimenticios (n=37) que consumían las vacas al momento de la toma de muestra de leche (variando de 1 a 3 muestras por productor). Debido a la variabilidad de suplementos colectados, se agruparon en dos grupos, “ensilados” (22/37) y “concentrados” (15/37). Las muestras de ensilados (silo bolsas) se obtuvieron manualmente de la abertura mediante calador colocado en tres direcciones (superior, media e inferior) en cinco puntos diferentes. Mientras que, para los concentrados, muestras representativas se obtuvieron directamente de las bolsas que estaban siendo administradas a las vacas en producción. Las muestras individuales de cada suplemento fueron homogeneizadas, refrigeradas y trasladadas para su procesamiento al Laboratorio de Toxicología de Facultad de Veterinaria (FV-UdelaR). Los suplementos se almacenaron en bolsas y la leche en frascos herméticos a -18ºC hasta el momento de los análisis, en un plazo menor a 30 días. Los tipos de alimentos muestreados fueron para el grupo “ensilados” silo de grano húmedo de sorgo (11/22), de planta entera de sorgo (1/22) y de planta entera de maíz (10/22), mientras que el grupo “concentrados” estuvo integrado por afrechillo de arroz (3/15), pellet de soja (1/15), lex de maíz (1/15), ración totalmente mezclada (3/15), cascarilla de soja (3/15) y de cebada (1/15), maíz americano (2/15) y semitín de arroz y trigo (1/15).
Determinación de pH y Humedad
Para medir pH se pesaron 10 g de muestra y se homogeneizaron con 100 mL de agua destilada utilizando un pH metro digital (pH 5+, Oakton, Vernon Hills, IL, USA) previamente calibrado con una solución buffer de pH 7 a 25ºC. El porcentaje de humedad, se calculó como la diferencia entre 100 y la materia seca, determinando la materia seca de acuerdo al método oficial de la AOAC, procedimiento 934.01 (AOAC, 1997). Ambas mediciones se realizaron por triplicado.
Determinación de aflatoxinas en alimentos y leche
Los niveles de AF (µg/kg) se cuantificaron mediante ensayos de inmunoabsorbancia ligado a una enzima (ELISA) competitivo directo Ridascreen® Aflatoxin, R-Biopharm, Alemania. Para ello se pesaron 5g de la muestra de alimento, realizando la extracción de las AF con metanol al 70%. Se filtró y se diluyó con agua destilada. Se utilizaron 50 µL de muestra diluida para la técnica de ELISA (RIDASCREEN® FAST). Los niveles de AFM1 (µg/L) se determinaron por duplicado con la misma metodología, utilizando un kit Ridascreen®Aflatoxin M1 de R-Biopharm, Alemania. Las mediciones se realizaron con espectrofotómetro (Bio-Tek® Instruments. Inc. Modelo EL301, Winooski, VT, USA) a una longitud de onda de 450 nm. Los resultados de los niveles de AF y de AFM1 fueron calculados con software especializado RIDA®SOFT (R-Biopharm - Alemania). Los niveles de AF fueron calculados según la curva de calibración provista por el fabricante con valores estándares de 2, 4, 10, 20, 50 y 100 µg/kg, con un coeficiente de determinación (R2) de 0,994. Para AFM1, la curva de calibración fue generada con las soluciones estándares 0, 5, 10, 20, 40 y 80 µg/L, con un R2 de 0,989.
Análisis de datos
Los datos se analizaron en primera instancia con estadística descriptiva y se presentan como promedio ± desvió estándar o porcentaje. El análisis estadístico se realizó sobre la variable de respuesta AF (previa transformación logarítmica) mediante modelos lineales mixtos (MLM), ajustando como efecto fijo a “suplemento”, “pH” y “humedad”. La identificación del “establecimiento” y él “tipo de alimento” anidado al establecimiento fue incluido en el modelo como efecto aleatorio. Para la simplificación de los modelos se incluyeron las interacciones y la significación de cada variable, se utilizó el criterio de información de Akaike (Sakamoto et al. 1978) con los análisis estadísticos de estimación de máxima verosimilitud restringida (REML) y la representación gráfica de los supuestos. Para la comparación entre los distintos niveles de tratamiento se consideró un nivel de confianza de 0,05. Todos los análisis fueron realizados utilizando la función lmer de la librería «nlme» del software R, versión 3.2.2 (R Development Core Team, 2015). Finalmente, se aplicó la prueba de correlación de Pearson para relacionar las concentraciones de AF con AFM1.
Resultados y Discusión
Del análisis de los datos de AF surge que en el presente estudio los valores de porcentaje de humedad y pH no representaron ser variables predictivas significativas (P>0,05), siendo el suplemento la única variable explicativa en el modelo final.
Los valores de pH variaron de 3,85 a 7,50 con un promedio de 5,29 (6,08 y 4,75 para concentrados y ensilados respectivamente), mientras que para los valores de humedad variaron de 11,6 a 76,5 con un promedio de 37,5 (14,1 y 56,4 para concentrados y ensilados respectivamente). Si bien, otros autores indican el riesgo que implica la relación entre humedad/pH y la presencia de hongos, en nuestro estudio los valores de AF indicaron una distribución aleatoria e independientemente al rango de valores de porcentaje de humedad y pH (Figura 1).
Figura 1: Valores de aflatoxinas (µg/kg) en función del pH y humedad (%) en suplementos alimenticios de 18 establecimientos lecheros de las regiones centro-sur de Uruguay.
La mayoría de las muestras de los suplementos alimenticios (34/37) presentaron niveles de AF, los resultados se expresan en la tabla 1. Dos de las 34 muestras (5,8%) superaron los niveles de 20 µg/kg máximo recomendado por el Ministerio de Ganadería Agricultura y Pesca (MGAP) para raciones destinadas a ganado lechero. Ambas muestras fueron silos de granos húmedos de sorgo sugiriendo un potencial riesgo de contaminación en este tipo de alimentos. Se evidenció una mayor variabilidad en la concentración de AF en los ensilados con respecto a los concentrados (tabla 1). La incorporación de la variable “tipo de alimento” anidada al “establecimiento” en los efectos aleatorios contribuyó a explicar 21,7% de la variabilidad de los resultados (R2m= 19,6 - R2c=41,3). Estos datos adquieren una importancia significativa considerando la gran difusión del ensilaje de granos húmedos y la variabilidad de granos que existe en Uruguay para su elaboración (Chakling y Brasesco, 1997). Más aún en los establecimientos lecheros donde existe una diversidad en la composición y cantidad de alimentos destinados a vacas lecheras en producción (Cajarville et al., 2012). Estudios específicos realizados en 20 muestras de silos de grano húmedo de sorgo, encontraron baja contaminación de hongos toxicogénicos, reportando un 10% con niveles de AF (García y Santos et al., 2012). La técnica utilizada para la cuantificación fue la misma que la del presente trabajo. Los niveles encontrados fueron inferiores a los recomendados por el MGAP. En México, Velázquez et al. (2009), utilizando la metodología de ELISA, reportaron porcentajes de contaminación similares a los encontrados en nuestro trabajo. De las muestras que analizaron, el 92,5% (37/40) de las raciones para bovinos lecheros presentaron niveles de AF en un rango de 4,8 a 24,9 µg/kg. De estas un 9,3% presentaron niveles superiores a 20 µg/kg, límite máximo permitido por la legislación de ese país.
Tabla 1: Presencia natural de aflatoxinas, discriminadas por tipo de suplemento alimenticio utilizado en 18 establecimientos lecheros de las regiones centro-sur de Uruguay.
Los valores se expresan en porcentaje, media aritmética de los datos observados (rango) y estimados por el modelo estadístico (intervalo confianza 95% (IC)), * p = 0,003 MLM
Todas las muestras de leche (n=18) presentaron niveles de AFM1, en un rango comprendido entre 0,005 a 0,08 µg/L. De estas, el 11% mostraron niveles superiores a 0,05 µg/L, límite establecido para la exportación de leche entera a la Unión Europea. El consumo prolongado de bajas concentraciones de AFM1, como las analizadas, representaría un factor de riesgo para la salud pública, debido a que la leche es un componente importante de la dieta humana, principalmente en niños (López et al., 2003; Prandini et al., 2009). Sin embargo, ninguna de las muestras superó los niveles permitidos por la reglamentación vigente del MERCOSUR (0,5 µg/L).
Otros autores evaluaron leche cruda en México, utilizando un kit de ELISA de RomerLabs®, reportando 80% (32/40) de muestras con niveles de AFM1, con un rango de 0,006 a 0,065 µg/L. El 7,5% de las muestras (3/40) superaron los niveles de 0,05 µg/L permitidos para la comunidad europea (Velázquez et al., 2009). En Brasil Sassahara et al., (2005) reportaron 24% de muestras de leche cruda (10/42), con niveles AFM1 presentando el 7% de las mismas, niveles superiores a los permitidos por ANVISA. La leche fue analizada mediante kit de ELISA comercial (Ridascreen® Afla M1, Fast, Alemania). Para el mismo país, estudios realizados en leche consumo, utilizando como herramienta de medición la técnica de Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC), reportaron un 82% (50/61) de muestras positivas para AFM1 (Prado et al., 1999). Los rangos determinados fueron de 0,006 a 0,077 µg/L. El 5% (3/61) alcanzaron niveles superiores a la normativa europea (0,05 µg/L). En Argentina un estudio realizado por Michlig et al. (2016) en leche proveniente de tanque de frío de establecimientos comerciales, reportaron 38,8% (62/160) muestras con niveles inferiores a 0,5 µg/L, cuantificados por la metodología de HPLC, no superando los niveles permitidos por la reglamentación del MERCOSUR.
Los niveles de AFM1 reportados en los distintos trabajos fueron muy diversos, ello podría explicarse principalmente por la alimentación que recibían los animales y por la metodología de análisis empleada para la determinación de AFM1. Los alimentos que reciben los animales pueden presentar distinto grado de contaminación, según las regiones, época del año, factores climáticos y condiciones de almacenamiento (Sassahara et al., 2005). Es conocido que en regiones tropicales existe mayor riesgo de contaminación por AF totales que en regiones templadas. (Yiannikouris y Jouany, 2002). También son los métodos analíticos utilizados los que pueden intervenir en la diversidad de los resultados. Peng et al. (2016) desarrollaron y validaron un ensayo de inmunoabsorción con anticuerpos monoclonales para determinar niveles de AFM1 en leche con una alta correlación positiva (r=0.99), demostrando que el método ic-ELISA es muy confiable. No obstante, Rosi et al. (2007) recomiendan que las muestras positivas obtenidas por la metodología de ELISA sean confirmadas por HPLC debido a posibles interferencias que puedan existir en dicha metodología.
En el presente estudio, los niveles de AF no se correlacionaron con los niveles de AFM1 (r=0,003; p=0,91). La falta de asociación pudo deberse a que la AFM1 excretada en leche, es derivada de la AFB1 y en este trabajo se determinó AF totales y no AFB1. A su vez, Turner et al. (2009) mencionan que las micotoxinas en los alimentos no se distribuyen de manera homogénea ni suelen encontrarse en grandes cantidades, lo que podría influir sobre el muestreo y posterior análisis de las mismas.
Conclusiones
En la mayoría de los alimentos evaluados en este estudio se cuantificaron niveles de AF, siendo los ensilados los de mayor contaminación. En leche, los niveles de AFM1 no representaron riesgo para la salud pública, ya que no superaron los niveles máximos permitidos para su consumo en Uruguay. No obstante, la presencia de éstos metabolitos demuestra un riesgo potencial, por lo que es importante seguir realizando estudios para determinar la incidencia de AF en alimentos y AFM1 en leche.
