Introducción:

La enteropatía proliferativa porcina (EPP) es una enfermedad infecciosa transmisible, ampliamente difundida en todo el mundo, de gran importancia económica en producciones suinas comerciales. La EPP es una enfermedad endémica de presentación clínica y/o subclínicaquepuede asociarse a pérdidas económicas significativas (^{McOrist, 2005}). En América del Sur, la EPP puede alcanzar prevalencias de hasta 90% (^{Franca y col., 2008}),siendo en Brasil y Argentina una importante causa reportada de diarrea en cerdos en crecimiento y terminación (^{Guedes, 2008}; ^{Pérez y col., 2016}). El agente causal es Lawsonia intracellularis, una bacteria Gram-negativa, intracelular obligada, que se multiplica en la región apical del citoplasma de los enterocitos mediante un proceso de “parasitismo energético”, que le permite defenderse del estrés oxidativo celular y aprovechar las reservas de energía de la célula huésped (^{Vannucci y Gebhart, 2014}). La replicación bacteriana intracelular se acompaña por la proliferación de las células inmaduras de las criptas intestinales (^{McOrist y col., 1995}; ^{Vannucci y Gebhart, 2014}). La EPPse describió por primera vez en cerdos en 1931, caracterizándose las lesiones macro y microscópicas, pero sin poder establecerse la causa (^{Biester y Schwarte, 1931}), hasta la década de los `90, cuando se reportó el primer aislamiento de L. intracellularisen cerdos(^{McOrist y col., 1993}; ^{McOrist y col., 1995}).Actualmente se reconocen cuatro formasanatomopatológicas de EPP: 1)-Adenomatosis intestinal porcina (AIP); 2)-Enteritis necrótica (EN); 3)-Ileítis regional (IR); y 4)-Enteropatía proliferativa hemorrágica (EPH) (^{Rowland y Lawson, 1975}; ^{Jacobson y col., 2010}; ^{Uzal y col., 2016}). La AIP,de curso crónico, ocurre principalmente en cerdos de 6 a 20 semanas de edad; en tanto que la EPH, de curso agudo, afecta principalmente a cerdos de 4-12 meses. La AIP suele desarrollarse sin complicaciones, con la recuperación de la mayoría de los animales y con una mortalidad baja (<5%), excepto que se presenten infecciones secundarias o asociadas. En estos casos puede tener lugar la manifestación de EN, con lesiones más graves y alta mortalidad (^{Lawson y Gebhart, 2000}; ^{Jacobson y col., 2010}). Desde el punto de vista patológico, todas las presentaciones se caracterizan macroscópicamente por el engrosamiento y el aspecto corrugado de la mucosa intestinal,principalmente en el íleony, en menor medida,en el ciego y colon (^{Lawson y Gebhart, 2000}; ^{McOrist y Gebhart, 2012}) y microscópicamente,por la hiperplasia de criptas,la proliferación de enterocitos inmadurosy la disminución del número total o parcial de células caliciformes (^{Uzal y col., 2016}). La ENse caracteriza por la ocurrencia de necrosis intestinal, mientras que, en la IR,cambios reparativos se agregan a la proliferación de enterocitos (^{McOrist y Gebhart, 2012}; ^{Uzal y col., 2016}).

Trichuris suis, el “gusano látigo” del cerdo, es un nematodoparásito del ciego y colon, que se encuentra ampliamente distribuido en las granjas porcinas. Las infestaciones leves suelen ser asintomáticas, pero en infestaciones graves,T. suispuede causar colitis hemorrágica y/o fibrinonecrótica con diarrea severa (^{Greve, 2012}). La intensidad del cuadro no sólo depende del grado de infestación parasitaria, sino también de la presencia simultánea de bacterias enteropatógenas; se ha demostrado que T. suis actúa sinergísticamente con Campylobacter jejuni y Brachyspira hyodysenteriae (^{Rutter y Beer, 1975}; ^{Pittman y col., 2010}). En este contexto, se ha planteado además una posible asociación sinérgica entre la infección por L. intracellularis y la infestación por T. suis (^{Mansfield y Urban, 1996};^{Pearce, 1999}).

Balantidium coli es un protozoario comensal del intestino grueso del cerdo,que actúa como reservorio del mismo, y es un hallazgofrecuente en el lumen del ciego y colon normales. Balantidium colise alimenta de células, mucus y bacterias intestinales, y,a pesar de que no es considerado un patógeno primario en el cerdo, puede actuar como un patógeno oportunista al invadir la mucosa intestinal previamente dañada por otros parásitos omicrorganismos (^{Schuster y Ramirez-Avila, 2008}). En el cerdo es frecuente encontrarlo en casos de infección por B.hyodysenteriae, pero también en el borde de lesiones ulcerativas o necrotizantes crateriformes del intestino grueso debidas a AIP o Salmonella Typhimurium(^{Taylor y col., 2016}; ^{Uzal y col., 2016}).

El objetivo del presente trabajo es describir un casode EPP por L. intracellularis en coinfección con T. suis y B. coli. Según nuestro conocimiento, esta representa la primera comunicación escrita deEPPen un cerdo de Uruguay en la literatura científica.

Materiales y métodos:

En octubre de 2015 la División de Laboratorios Veterinarios (DILAVE) Regional Este, Uruguay, investigó un episodio de mortandad de lechones en un criadero ubicado en la 9º sección del departamento de Treinta y Tres, Uruguay. El criadero era de tipo familiar, semi-intensivo, de flujo continuo, con parcelas de campo de 50x50m, cada una con 3 cerdas madres y sus respectivos lechones. La alimentación era a base de una ración de inicio. El problema afectó a una piara de 130 lechones, cruza Hampshire, Duroc y Landrace, de 1 a 3 meses de edad, de los cuales enfermaron 18 (incidencia acumulada 14%) y murieron 15 (letalidad 83%) en un período de 30 días. Los lechones afectados presentaron diarrea profusa, deshidratación, adelgazamiento progresivo y debilidad, evolucionando a la muerte en un período de 7 a 10 días.

Para el estudio postmortem, se sacrificó y se realizó la necropsia de un lechón afectado, de 2 meses de edad. Muestras de estómago, intestino delgado (duodeno, yeyuno e íleon), válvula ileocecal, ciego y colon, y de otros órganos, se fijaron en una solución neutra de formaldehído al 4%, se procesaron rutinariamente para histología, se seccionaron a 5-7 µm de espesor y se colorearon con hematoxilina y eosina (H&E). Para la identificación de L. intracellularisy Brachyspira spp., muestras de íleon y ciego se colorearon con la técnica de Warthin-Starry (WS) para bacterias intracelulares curvadas y espiroquetas (^{Luna, 1968}). Además, para la identificación de L. intracellularis, las mismas muestras se procesaron por inmunohistoquímica (IHQ) según la técnica descripta por (^{Machuca y col., 2008}),en el Laboratorio de Patología Especial Veterinaria de la Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata, Argentina. Complementariamente, se procesaron muestras formoladas-parafinadas de intestino para detección de genes específicos de B. hyodysenteriae, B. pilosicoli y L. intracellularis mediante la técnica de PCR, según lametodología descripta por (^{Pérez, 2016}).

Resultados:

A la necropsia se observó mal estado corporal, con atrofia de grasa peri-renal y cardíaca. En la última porción del íleon, la mucosa estaba engrosada y presentaba múltiples pliegues que le daban un aspecto cerebroide (Figura 1). En la mucosa del ciego y colon se observaron erosiones y úlceras de 2 mm de diámetro recubiertas por membranasdiftéricas adheridas a la mucosa (Figura 2), debajo de las cuales había numerosos nematodes adultos compatibles conT. suis fijados a la mucosa (Figura 2recuadro). Los demás órganos no presentaron lesiones.

A la histología, el íleon presentaba las criptas hiperplásicas, ramificadas, con marcada reducción del número de células caliciformes, mientras que en otras áreas presentabanecrosis y exfoliación de enterocitos superficiales y atrofia de vellosidades. En la lámina propia se observaba un infiltrado linfocítico e histiocítico, moderado y difuso. El ciego presentaba proliferación de enterocitos inmaduros en la profundidad de las criptas, las que se mostraban elongadas, ramificadas, con epitelio pseudoestratificado ymarcada reduccióndel número de células caliciformes (Figura3). También se reconocieron múltiples áreas de necrosis superficial y ulceración con restos celulares necróticos, exudado fibrinosupurativo, hemorragia, y numerosos protozoarios morfológicamente compatibles con trofozoitos deBalantidium colien la superficie necrótica (Figura 4). La frecuencia de B. coli resultó escasa o nula en áreas sin lesiones o levemente afectadas. En algunas regiones del ciego se observaron nematodes compatibles con T. suisen las criptas y unmoderado infiltrado inflamatorio linfocítico, histiocítico y eosinofílico difuso en la lámina propia.

Figura 1: Enteropatía Proliferativa Porcina. Última porción del íleon y ciego: con engrosamiento de la mucosa formando pliegues de aspecto cerebroide. Destacan restos fibrinosos adheridos a la mucosa del ciego. 

Figura 2: Ciego. Tiflitis fibrinosa extensiva, con restos de contenido intestinal digerido, adheridos a la mucosa. Recuadro: Ciego con numerosos ejemplares de T. suis con extremidad posterior libre en el lumen, fijados a la mucosa mediante su extremidad anterior fusiforme debajo de la membrana fibrinosa. 

Figura 3: Enteropatía Proliferativa Porcina. Ciego. Se observa hiperplasia de las criptas, presentándose elongadas, ramificadas, con epitelio pseudoestratificado y carentes de células caliciformes. Nótese la presencia de B. coli en el exudado fibrinoso y adheridos a la mucosa. Coloración de H&E. 

Figura 4: Ciego. Se presentan áreas de necrosis superficial y ulceración con restos celulares necróticos, exudado fibrinosupurativo y hemorrágico y numerosos trofozoítos de B. coli en lasuperficie necrótica. Coloración de H&E. 

Con la coloración de WSse observaron bacterias bacilares curvadas intracelulares apicales,tanto en los enterocitos de revestimiento como enlos de las criptas en el íleon yel ciego. No se encontraronespiroquetas compatibles con Brachyspira spp.En la IHQse observó intensa inmunomarcación para L. intracellularis en el citoplasma apical de los enterocitos de las criptas hiperplásicas del íleon y del ciego, que fue más intensa y abundante en el ciego (Figura 5). También resultó evidente la marcación positiva intracitoplasmática de los macrófagos de la lámina propia y de B. coli (Figura 5).

Figura 5: Enteropatía Proliferativa Porcina. Ciego. Se observa intensa inmunomarcación de L. intracellularis en el citoplasma apical de los enterocitos de las criptas hiperplásicas del íleon. Nótese marcación positiva en el interior de B. coli. IHQ, cromógeno diaminobencidina, contracoloración de hematoxilina. Recuadro. Ciego con inmunomarcación de L. intracellularis en el interior de B. coli (flecha).IHQ, cromógeno diaminobencidina, contracoloración de hematoxilina. 

Discusión:

El diagnóstico presuntivo de EPP en este caso se estableció sobre la base de los hallazgos clinicopatológicos característicos de la enfermedad, sumados a la detección de L. intracellularismediante técnicas histológicas indirectas,tales como la coloración de WS e IHQ, que permitieron la demostración intralesional del agente en el cerdo necropsiado.

Los hallazgos clínicos y patológicos del presente fococoinciden con la forma de EN de la EPP (^{Rowland y Lawson, 1975}; ^{Jacobson y col., 2010}). Es posible especular que la acción conjunta de L. intracellularis y los parásitos presentes (particularmente T. suis), además de la influencia de otros factores predisponentes, tales como la introducción de animales de distintos orígenes, la mezcla de animales de edades disimiles, el flujo continuo y la exposición al medioambiente en los corrales, hayan contribuido a la transmisión de la bacteria, alta mortalidad y a la gravedad de las lesiones encontradas en el animal necropsiado (^{Bronsvoort y col., 2001}; ^{Jacobson y col., 2010}).Sin embargo, debido a que en este foco no se investigaron otros agentes causales de diarrea en porcinos, tales como Salmonella enterica, Escherichia coli, y agentes virales (^{Uzal y col., 2016}), no es posible descartar una contribución causal de estosagentes en el episodio de diarrea.

En la infección por L. intracellularis las lesiones ocurren principalmente en el íleon en estadios iniciales y, posteriormente, en el ciego y el colon (^{Lawson y Gebhart, 2000}). En el presente caso las lesiones más graves se observaron en ciego, asociadas a la presencia de T. suis y B. coli,junto con una marcada inmunomarcación de antígeno de L. intracellularis,principalmenteen los enterocitos, y en menor medida en macrófagos de la lámina propia. Estos hallazgos sugieren que la infección se encontraba en una etapa avanzada de su desarrollo.

En relación al resultado negativo de PCR para detección de L. intracellularis, el mismo pudo haberse debido a la baja sensibilidad de esta prueba (41%) cuando se realiza a partir de tejidos formolados-parafinados (^{Ladinig y col., 2009}), o a diversos factores que afectan la calidad del ADN, tales como el agente fijador, el tipo y tiempo de almacenamiento previos al parafinado y el método de extracción y purificación de ADN (^{Bustamante y col., 2011}). Debido a las dificultades que presenta la detección de L. intracellularis por medio de PCR en tejidos parafinados-formolados, la IHQ es el método de elección para el diagnóstico de EPP en este tipo de muestras (^{Ladinig y col., 2009}).

Los sistemas de producción con acceso a pasto y tierra, como el presente caso, sumados a la falta de limpieza de los corrales entre partos y a la ausencia de tratamientos antiparasitarios, favorecen la presencia de T. suis y la exposición temprana de los lechones al parásito. Trichuris suispuede provocar destrucción de las glándulas colónicas e inducir depresión de la inmunidad de mucosas (^{Pittman y col., 2010}), por lo que este parásito pudo haber contribuido a las lesiones observadas en el ciego en el caso descripto en este trabajo, y a la diarrea reportada en otros cerdos de la piara.

La presencia de B. coli se ha relacionado con el aumento y perpetuación de la necrosis del epitelio mediante la producción de enzimas proteolíticas que destruyen el epitelio superficial intestinal, resultando en ulceración de la mucosa (^{Taylor y col., 2016}). Como ocurre con otros patógenos entéricos del cerdo, tales como Salmonella Typhimurium y B. hyodysenteriae (^{Hampson, 2012}), la lesión de la mucosa intestinal debida a L. intracellularis crea un ambiente favorable para la proliferación de organismos oportunistas. En el presente caso,los numerosos trofozoitosdeB. coli en las zonas ulceradas, adheridos a la mucosa necrótica y en la lámina propia, sugiere su posible implicancia como patógeno oportunista (^{Taylor y col. 2016}; ^{Uzal y col., 2016}). Además, la identificación mediante IHQ de L. intracellularis en el interior de B. coli sugiere un posible rol de este protozoario enla trasmisión de L. intracellularis que debería ser mejor investigado(^{Jensen y col., 2010}). Es conocida la internalización de bacterias por otros protozoarios bacterívoros distintos de B.coli, que así brindan protección y permiten la supervivencia, replicación y distribución de bacterias en el ambiente (^{Barker y Brown, 1994}).

Conclusión:

El presente trabajo describe un caso de enteropatía proliferativa porcina por L. intracellularisen Uruguay, remarcando que este agente debe ser considerado en el diagnóstico diferencial en cerdos con diarrea en el país. La gravedad de las lesiones observadas sugiere la posible contribución de T. suis y B. coli en el desarrollo de las lesiones entéricas. Estudios más extensos son necesarios para evaluar la distribución, frecuencia e impacto económico de esta condición en Uruguay. Se advierte la necesidad de vigilancia de L. intracellularisante las significativas pérdidas que este agente puede generaren la producción porcina.