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Revista Médica del Uruguay

Print version ISSN 0303-3295

Rev. Méd. Urug. vol.18 no.3 Montevideo Dec. 2002

 

Caracterización genotípica de 80 cepas del género Mycobacterium en Uruguay

MSc. María Noel Cortinas1, Lic. Marina Fernández2, Dras. María Inés Valeta3, María del Rosario Uriarte4, María Cristina Mogdasy5

Resumen

Los métodos tradicionales de identificación fenotípica del género Mycobacterium son lentos y poco sensibles, requiriéndose cuatro a seis semanas para lograr un diagnóstico apropiado a partir de un cultivo positivo. Los procedimientos moleculares han permitido acortar este período, obteniéndose resultados entre las 36 a 72 horas.

En nuestro país la incidencia de M. tuberculosis es baja y no existen datos acerca de con qué frecuencia los casos diagnosticados como tuberculosis pulmonar son en realidad causados por Mycobacterium no tuberculosis (MNT), normalmente saprofitas.

Desde el punto de vista terapéutico, el diagnóstico etiológico a través de la identificación precisa de la especie de Mycobacterium infectante resulta un aporte significativo, dado que el tratamiento y el manejo de sus contactos son diferentes según sea la especie involucrada.

Por estas razones se introdujo en nuestro laboratorio el diagnóstico de Mycobacterium a través de su identificación genotípica. Para ello se eligieron dos marcadores moleculares de ADN: la secuencia de inserción IS6110, característica de los genomas del complejo

M. tuberculosis, y la secuencia del gen ribosomal 16s (ADNr 16s) para estudiar la identidad específica dentro del género Mycobacterium.

Una vez puestas a punto las técnicas moleculares seleccionadas, se procedió al estudio retrospectivo de una colección de 80 aislamientos, identificados como Mycobacterium por métodos fenotípicos. La mayoría de los aislamientos (75/80) resultaron cepas del complejo M. tuberculosis. Los restantes cinco fueron identificados como cepas MNT, tres de ellas causantes de infecciones pulmonares.

Palabras clave: MYCOBACTERIUM - genética.

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS - genética.

MICOBACTERIOSIS - diagnóstico.

GENOTIPO.

1. Magister en Ciencias Biológicas. Laboratorio de Biología Molecular de la Asociación Española Primera de Socorros Mutuos (AEPSM) y Profesor Adjunto del Centro Técnico de Análisis Genéticos (CTAG) de Facultad de Ciencias.

2. Licenciada en Laboratorio Clínico. Laboratorio de Análisis Clínicos de la AEPSM.

3. Médico Microbiólogo y Subjefe del Laboratorio de Análisis Clínicos de la AEPSM.

4. Doctora en Ciencias Biológicas. Investigador del Programa de Desarrollo de las Ciencias Básicas (PEDECIBA). Responsable del Laboratorio de Biología Molecular de la AEPSM.

5. Médico Microbiólogo, Jefe del Laboratorio de Análisis Clínicos y Consultante de Enfermedades Infecciosas de la AEPSM.

Institución responsable: Laboratorio Biología Molecular y Laboratorio de Microbiología. Asociación Española Primera de Socorros Mutuos.

Correspondencia: MSc. María Noel Cortinas.

Hugo Pratto 2298/901. Montevideo 11200, Uruguay. 19206 530.

mcortinas@asesp.com.uy - cmogdasy@asesp.com.uy

Recibido: 13/12/01.

Aceptado: 23/8/02.

Introducción

El género Mycobacterium comprende un grupo de microorganismos muy diverso, de amplia distribución en la naturaleza. Se han descrito más de 100 especies, 25 de las cuales han sido identificadas como agentes infecciosos frecuentes para el hombre(1). Además de los microorganismos del complejo Mycobacterium tuberculosis, existen especies saprofitas, pudiendo actuar como patógenos oportunistas y causar enfermedad pulmonar o infecciones en otras localizaciones(2,3).

La identificación rápida y precisa de las micobacterias a nivel de especie a partir de un cultivo positivo reviste importancia clínica y epidemiológica. Su identificación a nivel de especie permite la diferenciación entre patógenos habituales y oportunistas, definiendo, de esta manera, la conducta a seguir. Por ejemplo, la terapéutica a implementar varía dado que existen situaciones en que la indicación para una especie no es efectiva para otra. A su vez, permite presumir el hábitat natural y el reservorio (humano o ambiental), y determina la conducta a seguir con los contactos de los pacientes en tratamiento(3).

La identificación de Mycobacterium por técnicas de laboratorio convencionales (fenotípicas) es lenta, requiriendo entre tres a seis semanas para lograrla, con la implicancia terapéutica que ello conlleva. Adicionalmente, se reconoce que el resultado puede ser ambiguo o llegar a ser erróneo debido a que las técnicas en sí mismas son poco reproducibles(4). La expresión fenotípica dentro de una misma especie es variable y, en otros casos, varias especies pueden tener la misma expresión bioquímica. Por último, las bases de datos de las pruebas bioquímicas están descritas sólo para las especies más frecuentes y mejor conocidas lo que ocasiona un sesgo en la identificación hacia las especies tradicionalmente establecidas(4,5).

Los métodos alternativos de identificación más comunes provienen del desarrollo de técnicas moleculares aplicadas a la identificación genotípica. Estas técnicas están basadas en la amplificación de ADN bacteriano por PCR (reacción en cadena de la polimerasa)(6-8) acompañadas por el estudio de polimorfismos generados por la digestión con enzimas de restricción(9), la hibridización con sondas específicas(10), o la secuenciación de cadenas nucleotídicas(11-13).

La introducción de técnicas moleculares para la identificación de Mycobacterium en la rutina del laboratorio clínico ha proporcionado dos grandes ventajas respecto a la identificación fenotípica: se reduce el tiempo de estudio de los aislamientos (36 a 72 horas en lugar de tres a seis semanas) y la identificación definitiva no depende de criterios subjetivos(5).

Una gran variedad de marcadores ha sido ensayada en la última década(1,3,7,9,11,12,14). De todos ellos se han seleccionado para este estudio la secuencia de inserción IS6110, característica de los genomas del complejo M. tuberculosis, y la región hipervariable 5' del gen 16s ARNr ribosomal para la identificación de las especies a nivel del género Mycobacterium (anexo)(1,3,5,9,14-17).

La secuencia de inserción IS6110 es el marcador de uso más difundido para el complejo Mycobacterium tuberculosis(5,6,9), y el análisis de la secuencia ADN 16s ribosomal se ha convertido en el "standard" para la identificación de organismos de todo el género Mycobacterium en los centros de referencia donde la secuenciación automática está disponible(8,12). Teniendo en cuenta estos antecedentes, fueron planteados los siguientes objetivos:

a) introducir, en nuestro medio, técnicas moleculares para la identificación de especies del género Mycobacte-rium;

b) identificar a nivel de especie una colección de aislamientos del pasado y recientes, caracterizados fenotípicamente como Mycobacterium, en el Laboratorio de Microbiología de la Asociación Española Primera de Socorros Mutuos (AEPSM).

Material y método

Muestras

Se procedió a estudiar una colección de 80 aislamientos identificados como Mycobacterium por métodos fenotípicos en el laboratorio de la AEPSM. Dicha colección contiene aislamientos realizados entre los años 1990 a 1999. Las cepas fueron aisladas en medio de Lowenstein Jensen, procedentes de muestras clínicas enviadas al Laboratorio de Microbiología para investigación de micobacterias.

El ADN bacteriano de cada una de las cepas cultivadas se aisló con el sistema de extracción de ADN de Qiagen, QiampR DNA Mini Kit, según las instrucciones del mismo.

Marcadores moleculares utilizados

Estudio del marcador IS6110, específico para el complejo M. tuberculosis

Las amplificaciones de los fragmentos de inserción fueron realizadas por PCR (reacción en cadena de la polimerasa), utilizando los "primers" T4 y T5(6) y 36 ciclos con el siguiente perfil térmico de tres pasos: 95ºC, 2 minutos; 69ºC, 2 minutos y 72ºC, 1 minuto, más una extensión final de 7 minutos. Luego de la electroforesis en geles de agarosa a 2%, los productos de amplificación fueron visualizados con tinción de bromuro de etidio. La identificación de bandas se realizó por comparación con un marcador de peso molecular. En cada experimento fue incluido un control negativo, un control positivo, junto con controles de inhibición de cada muestra. Estos últimos, utilizados para descartar resultados falsos negativos, consisten en reacciones que contienen ADN de las muestras problema contaminadas con ADN de Mycobacterium tuberculosis del control positivo.

Para confirmar la especificidad de nuestros ensayos se realizó la secuenciación de las bandas amplificadas, coincidentes con los pesos moleculares esperados.

Identificación de ADNr 16s por secuenciación

Las amplificaciones de los fragmentos fueron realizadas por PCR, utilizando los "primers" 244, 285, 264, y 259(8). En este caso las condiciones de amplificación fueron: 95ºC, 2 minutos; 69ºC, 3 minutos y 72ºC, 1 minuto, más una extensión final de 7 minutos por 36 ciclos. Luego de la electroforesis en geles de agarosa a 2%, los productos de amplificación fueron visualizados con tinción de bromuro de etidio. Se utilizaron controles positivos, negativos y de inhibición. Se procedió a la identificación de especie por secuenciación automática con un equipo ABI 310 y utilizando Sequencing Prism Mix, ambos de Applied Biosystems.

Los excesos de enzima, nucleótidos y sales de los productos de PCR 16s ARNr fueron extraídos antes de realizar las reacciones de secuenciación haciendo pasar los productos a través de columnas Centrisep (Princeton).

Creación de una base de datos del género Mycobacterium

Las secuencias utilizadas para la creación de nuestra base de datos fueron extraídas a partir de las bases de datos de acceso público, GenBank y Ribosomal Database.

Análisis de las secuencias obtenidas

Los resultados de las corridas fueron analizados y corregidos con el paquete informático Sequencing Analysis y Sequence Navigator (Applied Biosystems). Posteriormente fueron reconocidas con Blast (NCBI), luego alineadas con Clustal W 1.07(18) y la reconstrucción filogenética fue realizada con PAUP(19), utilizando métodos de parsimonia, distancia y 1.000 réplicas de bootstrap para asignar el apoyo estadístico recibido por los distintos agrupamientos. En el caso de las reconstrucciones por parsimonia se realizaron búsquedas de tipo heurístico y luego el árbol consenso. En el caso de los análisis por distancias se utilizó Kimura con dos parámetros y Neighbor Joining como algoritmo de agrupamiento. La secuencia de Nocardia asteroides fue utilizada como grupo externo(8).

Resultados

Se procedió a la amplificación de ambos marcadores moleculares por PCR a partir de las extracciones de ADN (figura 1). De los 80 casos estudiados fueron obtenidas 75 amplificaciones positivas para el marcador IS6110. Las cinco muestras negativas mostraron amplificación cuando fueron contaminadas con ADN de M. tuberculosis, descartándose resultados falsos negativos.

La amplificación de fragmentos de ADN 16s ribosomal fue confirmada para los 80 casos, primero por tamaño en geles de agarosa y luego mediante la secuenciación automática de los productos amplificados con los métodos descritos.

Las secuencias generadas fueron revisadas manualmente con ayuda del programa Sequence Navigator. Su alineamiento preliminar y comparaciones usando Blast (NCBI), mostraron la existencia de un grupo de secuencias que se asociaban a las secuencias de M. tuberculosis depositadas en GenBank y de otro grupo, de cinco secuencias, coincidentes con las muestras negativas para IS6110 que se asociaron con cepas de micobacterias distintas de M. tuberculosis.

La incorporación de estas secuencias en un análisis filogenético junto con la base de datos generada a partir de GenBank y Ribosomal Database, permitió constatar que 75 cepas, positivas para el marcador IS6110, formaban un "cluster" compartiendo la posición topológica con la secuencia de referencia de M. tuberculosis (figura 2).

Las cinco cepas que resultaron con amplificación positiva sólo para el fragmento de ADN 16s se clasificaron en el árbol filogenético junto a distintas micobacterias Mycobacterium no tuberculosis (MNT). Dos de ellas se agruparon con las secuencias de referencia de M. kansasii; otras dos con secuencias de M. fortuitum y la restante se agrupó con la secuencia de M. xenopi (figura 2).

Como se muestra en la tabla 1, la frecuencia de aparición de M. tuberculosis y MNT fue 93,7% y 6,3%, respectivamente, con un predominio general de muestras de procedencia respiratoria. Dentro de las MNT, dos M. kansasii, una M. fortuitum y una M. xenopi se identificaron a partir de aislamientos de expectoración de pacientes con infecciones de localización pulmonar. La restante M. fortuitum se obtuvo a partir de una fístula de pierna, localización habitual para las infecciones oportunistas causadas por esta especie.

El estudio de las historias clínicas de los cuatro pacientes con enfermedad pulmonar MNT permite apreciar que se presentaron como cuadros respiratorios prolongados, radiológicamente compatibles con tuberculosis pulmonar y, como tales, tratados con triple plan que incluía pyrazinamida (tabla 2)(20).

Discusión

Hemos caracterizado con marcadores moleculares una colección de aislamientos realizados durante la década de 1990 por nuestro laboratorio, reconocidos como pertenecientes al género Mycobacterium.

Las condiciones de amplificación tanto del fragmento de inserción IS6110 como del fragmento ADNr 16s fueron optimizadas satisfactoriamente en nuestro laboratorio. Como era de esperar, se obtuvo la amplificación del fragmento ADNr 16s en los 80 aislamientos estudiados. Sin embargo, sólo 75 resultaron positivos para el marcador IS6110. La doble condición, negativos IS6110 y positivos para ADNr 16s en cinco muestras luego de la amplificación por PCR planteó dos alternativas: a) la ausencia de los fragmentos de inserción IS6110 en las mismas, aun perteneciendo al complejo M. tuberculosis, o b) la existencia de Mycobacterium no tuberculosis. La consideración de la alternativa a) se fundamenta en que se ha comprobado la ausencia de este fragmento de inserción en algunas cepas del complejo M. tuberculosis de países asiáticos(5,21). Sin embargo, para los casos de nuestra colección, la alternativa b) fue la correcta, al corroborarse por secuenciación automática que se trataba de secuencias características de MNT (figura 3).

Nuestros resultados indicaron, por tanto, que el fragmento de inserción IS6110 es un buen marcador para el diagnóstico de cepas del complejo M. tuberculosis en nuestro medio al igual que en otros países(9,14,15). Su principal ventaja radica en la rapidez para alcanzar el resultado requerido; se necesita sólo una reacción de PCR a partir del ADN extraído y la visualización de los productos se realiza con tinción de bromuro de etidio luego de realizada la electroforesis. No se requiere un sofisticado equipamiento y todos los procedimientos son realizables en un día de trabajo. Un resultado negativo de IS6110 no excluye la presencia de MNT.

El análisis de secuencias de ADNr 16s requiere de equipamiento más sofisticado, un secuenciador automático de ácidos nucleicos y bases de datos de referencia. La gran ventaja de esta metodología es, además de la rapidez, la amplitud de análisis posibles (todo el género Mycobac-terium) y la capacidad de reconocer nuevos genotipos de micobacterias aún no descritos(12,13). Por otra parte se elimina toda subjetividad en la interpretación así como los resultados falsos negativos. A diferencia de los fragmentos de inserción, las secuencias de ADNr 16s están siempre presentes porque forman parte estructural de los ribosomas(5). Un negativo en la amplificación sólo puede atribuirse a problemas en la extracción de ADN si los reactivos y el equipamiento funcionan correctamente.

Dado que la procedencia de la mayor parte de las muestras fue de origen respiratorio, no es sorprendente este predominio de M. tuberculosis (93,6%) respecto a MNT (6,4%).

La confirmación de aislamientos MNT fundamentalmente en localizaciones pulmonares señala la necesidad, desde el punto de vista asistencial, de establecer un diagnóstico a nivel de especie, aun en países de baja incidencia de M. tuberculosis siguiendo las recomendaciones de la American Thoracic Society (ATS)(20).

La identificación de M. kansasii y M. xenopi en expectoraciones coincide con los datos de Estados Unidos, Canadá y Europa donde estas micobacterias constituyen la primera o segunda causa más frecuente de infección pulmonar crónica causada por micobacterias no tuberculosis con presentación clínico-radiológica semejante a la tuberculosis(20,22).

Estos hallazgos muestran, además, la necesidad de establecer la correcta identificación de la micobacteria infectante para la implementación terapéutica. Por ejemplo, la resolución clínica espontánea de infecciones causadas por M. kansasii (de crecimiento lento en medios de cultivo al igual que M. tuberculosis) que se presentan clínicamente como "tuberculosis pulmonar" está descrita en muy pocos pacientes(22,23). La susceptibilidad antibiótica de este microorganismo es predecible. Es sabido que es resistente a algunos de los fármacos utilizados en el triple plan antituberculosis, por ejemplo pyrazinamida, y que los resultados de tratamientos que incluyen rifampicina son superiores a los que no la incluyen(22,23).

Esta precisión diagnóstica presenta dos ventajas: evita el estudio y eventual tratamiento de los contactos, y adquieren importancia los lugares donde el paciente habita ya que se reconoce como reservorio natural de estos organismos a las aguas más que a los suelos(3).

La confirmación de M. fortuitum, una micobacteria de rápido crecimiento, en un aislamiento de expectoración, merece algunas consideraciones: puede encontrarse allí como saprofita colonizando las secreciones respiratorias o ser el agente causal de un proceso broncopulmonar. Se adquiere por aspiración y no se reconoce la transmisión persona a persona(20,24). En los procesos broncopulmonares no existen elementos clínicos, radiológicos ni histopatológicos que sean diagnósticos. Su susceptibilidad es predecible e incluye amikacina, ciprofloxacina, cefoxitin y sulfas(22). El otro aislamiento de M. fortuitum se confirmó en una infección de partes blandas, con una presentación clínica habitual para esta especie.

Además de estos ejemplos, la experiencia internacional recoge otros casos donde la identificación de la micobacteria infectante junto con interacción médico-laboratorio ha sido importante para la correcta elección de las distintas posibilidades terapéuticas. Algunos de estos casos incluyen la distinción entre M. scrofulaceum de M. gordonae, entre M. fortuitum y M. abscessus, entre M. chelonae y M. mucogenicum(13), y en los pacientes inmunosuprimidos la posibilidad de establecer infecciones provocadas por micobacterias del complejo M. avium- intracellulare.

Finalmente, el estudio sistemático empleando técnicas moleculares como las descritas y otras complementarias revelarán la verdadera biodiversidad de especies de este género en nuestro país. Aunque los niveles de incidencia de tuberculosis en Uruguay son bajos(25), la situación regional y del mundo es diferente. Nuestros vecinos, Brasil y Argentina, presentan niveles de incidencia mayores(26,27) y problemas adicionales por la existencia de cepas multirresistentes(26-28). De acuerdo con los últimos informes de la Organización Mundial de la Salud, la tuberculosis es considerada una de las infecciones reemergentes a nivel mundial, esperándose que para el año 2010 ocupe el tercer lugar dentro de las enfermedades prevalentes(29).

La disponibilidad de estas tecnologías diagnósticas en nuestro medio preparará el terreno para permanecer atentos a estas realidades circundantes y a través de la evaluación de la biodiversidad se proveerán bases para su inclusión en futuros programas de vigilancia epidemiológica.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la técnica de laboratorio Mylene Rodríguez (AEPSM ) por la asistencia técnica en este trabajo.

Summary

Traditional methods to determine phenotype identification for mycobacterium are longer as compared with cellular procedures (4 to 6 weeks and 36 to 72 hours respectively).

In Uruguay, the incidence of tuberculosis Mycobacterium is low and data on pulmonary tuberculosis cases but caused by non-tuberculosis Mycobacterium (MNT) -normally saprophytes- is lacking.

From a therapeutic point of view, diagnosis based on an accurate identification of Mycobacterium infectant may be significant since treatment and management differ according to the strain found.

Two DNA molecular markers were chosen in our laboratory to diagnose Mycobacterium through genotype identification: IS6110 insertion element and ribosomal DNA sequences 16s (DNAr 16s) to determine specific identity within Mycobacterium.

Once selected molecular techniques were updated, we undertook a retrospective study of 80 isolates identified as Mycobacterium by phenotype methods. Most of the isolates (75/80) were tuberculosis Mycobacterium strains. The remained five were identified as MNT strains, of which three caused pulmonary infections.

Résumé

Les méthodes traditionnelles d'identification phénotypi-que du genre Mycobacterium sont lentes et peu sensibles, quatre à six semaines étant nécessaires pour avoir un diagnostic approprié à partir d'une culture positive. Les procédés moléculaires ont permis de raccourcir cette période: on obtient des résultants au bout de 36-72 heures.

Dans notre pays, l'incidence de M. tuberculosis est basse et il n'y a pas de registres pour savoir la fréquence avec laquelle les cas diagnostiqués comme tuberculose pulmonaire sont en réalité causés par Mycobacterium non tuberculose (MNT), normalement saprophytes.

Du point de vue thérapeutique, le diagnostic étiolo-gique à travers l'identification précise de l'espèce de mycobacterium infectante est un apport important, étant donné que le traitement varie selon l'espèce en question.

Voilà pourquoi on a introduit dans notre laboratoire le diagnostic de Mycobacterium à travers son identification génotypique. Pour ce faire, on a choisi deux marqueurs moléculaires d'ADN: la séquence d'insertion IS6110, caractéristique des génomes du complexe M.tuberculose, et la séquence du gène ribosome 16s (ADN 16s) pour étudier l'identité spécifique dans le genre Mycobacterium.

Une fois mises à point les techniques moléculaires sélectionnées, on fait une étude rétrospective d'une collec-tion de 80 isolements, identifiés comme Mycobacterium par des méthodes phénotypiques. La plupart des isolements (75/80) étaient des cèpes du complexe M. tuberculose. Les autres cinq ont été identifiés comme des cèpes MNT, dont trois étant la cause d'infections pulmonaires.

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