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Introducción
La Medicina Transfusional y Hemoterapia es una especialidad técnico-médica que se encuentra presente en Uruguay desde hace 70 años, representada por una Unidad Académica de la Facultad de Medicina.
En el marco de la investigación desarrollada desde esta Unidad, en 2018 se avanzó en el estudio de grupos sanguíneos y su importancia en la clínica, así como en el desarrollo de protocolos y la introducción de nuevas tecnologías para el diagnóstico en Uruguay1 . El objetivo de este proyecto es disponer de una nueva propuesta diagnóstica en las gestantes Rh(D) negativo.
La aloinmunización materna vinculada al grupo sanguíneo RhD ha transitado, desde su descubrimiento en 1939, a cargo de Karl Landsteiner junto con A. S. Weiner, por vertiginosos cambios desde el punto de vista de las transfusiones de sangre y, posteriormente, por su asociación con la mortalidad de los recién nacidos y fetos2 .
Este antígeno se encuentra ausente en el 15% de la población, lo que determina el carácter de RhD negativo y, en el caso de la gestación, la exposición a sangre RhD positivo de origen paterno puede determinar el desarrollo de la aloinmunización anti-D materno3, 4 .
En la década del 70 del siglo pasado se inició la administración de inmunoglobulina anti-D como forma de protección para las gestantes RhD negativas. Este hito de la Medicina Transfusional perinatal cambió la curva con una inflexión de la historia natural de la enfermedad hemolítica fetoneonatal (EHFN), disminuyendo la aloinmunización materna de 14% al 1,5% y, en consecuencia, la EHFN5–8.
La Medicina Transfusional ha tenido un crecimiento y expansión que refleja su vinculación con todas las especialidades implicadas directamente en el diagnóstico y tratamiento, adquiriendo un rol fundamental en la Ginecoobstetricia y la Pediatría/Neonatología en la prevención de la aloinmunización materna y el tratamiento de la EHFN. La UdelaR fue pionera en esta línea de trabajo, ya que desde hace más de 35 años se administra la inmunoglobulina anti-D específica en el puerperio en Uruguay, de manera obligatoria según la normativa vigente, labor por la que los autores fueron premiados por la Academia Nacional de Medicina del año 19829. Posteriormente, se implementaron intervenciones secuenciales orientadas a mejorar los resultados en esta enfermedad, reguladas por la autoridad sanitaria. En 2004 se actualizó la guía de seguimiento de la gestante en la prevención de la aloinmunización, sugiriendo la inmunoprofilaxis antenatal a las 28 semanas. Por último, en 2011, se incorporó la obligatoriedad de la prevención de la aloinmunización en la etapa antenatal a partir de las 28 semanas de edad gestacional, con la administración de inmunoglobulina anti-D específica10,11.
Es así que, mediante las intervenciones implementadas en las últimas tres décadas, se han logrado cifras de aloinmunización materna por antígeno D comparables con las cifras internacionales: 0,2% al 0,4% en Uruguay12,13.
Desde la última intervención en 2011 a la fecha, han surgido nuevas herramientas para optimizar la atención durante la gestación, con excelentes resultados neonatales. Una de ellas es la determinación del gen RHD en sangre materna14–16, que permite identificar a aquellas gestantes que portan un feto RhD positivo y que requieren la administración de inmunoglobulina anti-D durante la gestación, separando de aquellos fetos RhD negativos, que, al compartir el mismo grupo que su madre, no requerirían la inmunoglobulina anti-D. En la actualidad existen otras intervenciones para mejorar el manejo de la enfermedad, como el cálculo de la hemorragia feto-materna (HFM), el cálculo de dosis ajustada de la inmunoprofilaxis anti-D y el ensayo en monocapa de monocitos (monocyte monolayer assay [MMA]), técnicas que aún se encuentran en desarrollo en la práctica clínica rutinaria de nuestro país.
Dado que la aloinmunización es una condición que persiste durante toda la vida del individuo y que, para el antígeno D, es la única para la cual se dispone de un tratamiento preventivo desde la gestación, es de vital importancia adoptar oportunamente las conductas de intervención para su prevención, como la aplicación de la inmunoprofilaxis anti-D4,17. En este sentido, es necesario racionalizar el uso de la inmunoglobulina anti-D, dado que se trata de un hemoderivado proveniente del plasma humano, con un elevado costo para el Sistema Integrado de Salud, que garantiza cobertura equitativa a toda la población.
De acuerdo con los datos recabados en el Hospital de Clínicas a partir del Sistema Informático Perinatal (SIP), entre el 2008 y 2018 se identificó un 27% de madres Rh(D) negativas que eran portadoras de fetos Rh(D) negativos. Este hecho implica que este grupo de embarazadas recibió inmunoprofilaxis anti-D durante la gestación de forma innecesaria y se sometió a controles seriados de determinación de aloinmunización a lo largo del embarazo. Esta situación es representativa de lo que sucede a nivel nacional. Esta brecha entre la normativa que indica la administración de la inmunoprofilaxis a toda gestante Rh(D) negativa, aun con un feto del mismo grupo, pone de manifiesto la necesidad de avanzar en la detección del genotipo fetal durante la gestación, identificando aquellos fetos que, al ser RhD negativos, podrían ser pasibles a futuro de evitar la inmunoprofilaxis en una madre cuyo feto no tiene posibilidad de desarrollar la enfermedad. Asimismo, evitaría la monitorización innecesaria en este grupo de pacientes, reduciría los costos, evitaría efectos no deseados en una población sin beneficio clínico y disminuiría los riesgos de iatrogenia.
Nos planteamos el objetivo de evaluar el desempeño del método de detección molecular del gen RHD fetal a través de sangre materna, en términos de sensibilidad y especificidad, enfrentándolo al método de referencia posnacimiento, que es el estudio serológico en sangre de cordón. Este kit permite el estudio en embarazos de madres RhD negativas.
Materiales y métodos
En este trabajo se estudiaron casos provenientes de la Maternidad Universitaria, que recibe gestantes de todo el país para su asistencia, y de otro centro del subsector privado, ambos con servicios de Medicina Transfusional con tradición de colaboración y trabajo con otros centros, lo que permitió generar una red de colaboración multidisciplinaria para el análisis de gestantes y sus recién nacidos.
El desarrollo del estudio se llevó adelante con el consentimiento de las pacientes y respetando los requisitos establecidos por el Comité de Ética del Hospital de Clínicas. El protocolo de investigación fue presentado y aprobado con el número de resolución N.° 68/20 y registrado ante el Ministerio de Salud Pública con el N.° 800740.
Se trató de un estudio realizado en dos centros asistenciales del país, prospectivo, descriptivo, de cohorte única de pacientes. Estos centros fueron el Hospital de Clínicas Dr. Manuel Quintela de la Facultad de Medicina, UdelaR, y la Médica Uruguaya Corporación de Asistencia Médica (MUCAM), Uruguay.
Durante el período comprendido entre noviembre de 2020 y marzo de 2023 se incorporaron las gestantes RhD negativas, totalizando 92 pacientes RhD negativas, con embarazos de feto único. A cada paciente se le extrajo una muestra de sangre periférica entre las semanas 17 y 28 de gestación para la genotipificación RHD fetal, empleando un kit nacional de detección molecular del gen de interés.
Todas ellas presentaron un estudio previo de anticuerpos irregulares negativo, es decir, un estatus de no aloinmunización para el antígeno D a la fecha de toma de la muestra para la extracción de ADN y posterior estudio del gen RHD por PCR en tiempo real. El estudio incluyó pacientes usuarias de ASSE, del Hospital de Clínicas y de MUCAM.
Extracción de la muestra
Las muestras recogidas para el presente estudio fueron de sangre entera con EDTA y separadas a 3.000 rpm durante 15 minutos. El plasma obtenido fue almacenado a −20 °C hasta su procesamiento.
La extracción de ADN fetal libre en plasma materno se realizó en el Laboratorio de Patología Clínica, área de Biología Molecular del Hospital de Clínicas, utilizando el equipo QIAsymphony en conjunto con el kit Midikit de QIAGEN®. Para obtener una concentración óptima de ADN fetal y de acuerdo con las recomendaciones del fabricante del kit de PCR, se realizó una extracción de ADN a partir de 1,0 mL de plasma. El mismo fue eluido en un volumen final de 60 μL, de los cuales 25 μL fueron utilizados como molde para la PCR.
Dada la baja concentración de ADN fetal circulante en la sangre de las madres embarazadas, se reforzaron las medidas de protección durante la manipulación de la muestra para evitar la ocurrencia de falsos positivos por contaminación del operador. Estas medidas incluyeron el uso de doble guante, sobretúnica de un único uso por encima de la túnica, tapabocas y doble cofia, así como el trabajo dentro de una cabina de PCR. La extracción automatizada constituyó además una medida de protección de la muestra al disminuir los riesgos de contaminación.
Como control en cada ensayo, se incluyó el procesamiento de un plasma RhD negativo, proveniente del Banco de Sangre del Hospital de Clínicas para este ensayo. Se esperó que este control no presentara amplificación para ninguno de los tres exones en estudio, aunque sí se esperó la amplificación del control interno.
Real-time PCR
Para el presente trabajo se utilizó un kit de desarrollo nacional de ATGen SRL (#6067 Kit RHD Fetal Real TM) diseñado para la detección de RHD fetal. Este reactivo se basa en la amplificación de ácidos nucleicos por real-time PCR en formato multiplex con sondas TaqMan®,que permiten amplificar tres regiones diferentes del gen que codifica para la proteína D. Estas tres regiones se corresponden con los exones 5, 7 y 10. Este kit aún no se encuentra disponible para su comercialización.
De acuerdo con las condiciones establecidas por el kit, se trabajó con un volumen total de reacción de 50 μL (25 μL de mezcla de reacción y 25 μL de muestra ADN). Cada muestra se incluyó por duplicado. Se utilizó el equipo de PCR real-time Bio-Rad CFX96.
Las condiciones de ciclado fueron las indicadas en el inserto del kit:
Luego, 45 ciclos de:
Análisis estadístico
De acuerdo con los lineamientos detallados en las instrucciones de uso (IDK) del kit de detección molecular mediante PCR en tiempo real, una muestra puede ser categorizada como positiva cuando los tres exones son positivos, es decir, presentan amplificación típica con un Ct<35.
A los efectos de realizar el análisis estadístico que permita evaluar la sensibilidad y la especificidad del método utilizado, los resultados de la genotipificación fetal de RhD, tras el análisis de los exones, se expresaron como variables categóricas (positivo o negativo). De igual forma, la presencia o no del antígeno D en sangre de cordón del recién nacido también se expresó como variable categórica (positivo o negativo).
De forma adicional, para conocer el impacto que ejerce la amplificación de cada uno de los exones en los parámetros evaluados, se construyeron curvas ROC con los valores de Ct obtenidos para cada una de las muestras (utilizando el programa GraphPad Prism, versión 6.01).
Resultados
En total, se recolectaron 92 muestras que se procesaron según el siguiente flujograma (Figura 1). Por lo tanto, 87 muestras fueron incluidas en el presente análisis.
Evaluación de la sensibilidad y especificidad diagnóstica
De las 87 muestras analizadas, 57 fueron RHD positivas tanto por el método de referencia (determinación serológica del antígeno RhD en sangre de cordón postnacimiento) como por el kit de detección molecular empleado.
A su vez, de la interpretación de los resultados obtenidos con el kit de detección molecular se observó que las 57 muestras presentaron amplificación típica para las tres regiones evaluadas, con valores Cts concordantes entre ellos y cumpliendo con los criterios de adecuación definidos en el inserto.
Todas las muestras negativas para el gen RHD fetal (n=30), fueron negativas para los 3 exones que incluye el kit y se confirmó el estatus de negativas mediante determinación serológica del antígeno RhD en sangre de cordón postnacimiento.
En todas las corridas de amplificación obtenidas en el proceso de validación, no se registraron desvíos en cuanto a los valores obtenidos en los controles internos, según los criterios de aceptación definidos en el inserto. Dos ejemplos de dichas corridas se muestran en la Figura 2, correspondientes a un feto RHD positivo y un feto RHD negativo. En la Figura 2a se observan los 3 exones que a partir de 30 ciclos muestran su amplificación, lo cual no ocurre en la Figura 2b, en la cual solamente amplifica el control interno (amarillo).
Figura 2. Comportamiento de una muestra fetal RHD positiva (a) y una muestra RhD negativa (b), analizadas para los tres fragmentos amplificados y control interno.
Dicho control interno se agrega durante la extracción y permite asegurar que la extracción de ADN transcurrió sin problema y a su vez que la PCR funcionó sin inconvenientes. Se trata de un fragmento de ADN de secuencia conocida, diseñado por los desarrolladores. En condiciones de muestras negativas, de acuerdo a lo que está definido en el inserto, el control interno debe amplificar con un Ct<35. En condiciones de muestras positivas, el control interno puede presentar una amplificación posterior al punto de corte debido a la competencia por los reactivos a favor de los objetivos del gen RHD. Este comportamiento no invalida el ensayo.
En la Tabla 1 se muestra la referencia entre los fluoróforos y los exones utilizados. En la Tabla 2 se resumen los resultados de las corridas de PCR de ADN fetal y los resultados del grupo RhD obtenidos por serología al nacimiento.
Tabla 1. Criterios de adecuación del kit: detalle referente a la configuración de cada fluoróforo y el fragmento que representa.
Tabla 2. Resumen de los resultados de la comparación de las muestras según su estatus con el método de referencia.
Luego de la evaluación del desempeño del kit de detección molecular en comparación con la metodología de referencia, se observó concordancia perfecta entre los resultados obtenidos con ambas metodologías, sin la ocurrencia de falsos positivos ni de falsos negativos.
En total, para el presente análisis se consideraron 87 muestras procesadas, de las cuales 57 fueron positivas para el gen RhD y 30 fueron negativas.
Se observó una sensibilidad del 100% (IC95%: 93,7–100) y una especificidad del 100% (IC95%: 88,4–100) luego de la aplicación del modelo de Clopper-Pearson. (Tabla 3)
Tabla 3. Análisis de sensibilidad y especificidad clínica*.
*Para el análisis se consideró un intervalo de confianza de 95%.
Se observó una excelente correlación en la evaluación de la capacidad discriminante de cada exón a través de sus valores de Ct y los resultados obtenidos con el método de referencia. La construcción de curvas ROC para cada uno de los exones mostró un AUC de 1,0. (Figura 3)
Discusión y conclusiones
El presente trabajo se llevó adelante durante el período comprendido entre noviembre de 2020 y marzo de 2023. Si bien, con fines estadísticos y para alcanzar una precisión del ± 5%, hubiera sido conveniente la inclusión de un mayor número de muestras, la cantidad de muestras utilizadas fue la disponible durante el período de estudio y permitió estimar la sensibilidad y la especificidad (100% en ambos casos). Dado que el tamaño muestral fue sensiblemente inferior al esperado, consideramos que la construcción de las curvas ROC para evaluar la capacidad categorizante de cada exón aporta evidencia de relevancia sobre el desempeño del kit, reforzando la excelente capacidad diagnóstica observada.
La mayoría de los tratamientos médicos están diseñados para el “paciente promedio”, como un enfoque único que puede ser exitoso para algunos pacientes, pero no para otros. La medicina de precisión o “medicina personalizada” es un enfoque innovador para adaptar la prevención, el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades, teniendo en cuenta las diferencias en los genes, el entorno y los estilos de vida de las personas. El objetivo de la medicina de precisión es dirigir los tratamientos apropiados a los pacientes adecuados en el momento oportuno. Los avances en este campo ya han dado lugar a diagnósticos y tratamientos que se adaptan a características específicas de los individuos, como su genética, lo que mejora las posibilidades de supervivencia y reduce la exposición a efectos adversos20. En este sentido, el estudio aquí presentado constituye un claro ejemplo de avance hacia una medicina más personalizada. El interés en la capacidad diagnóstica del test radica en la individualización de las características específicas de cada paciente para la aplicación de terapias de mayor precisión.
La evidencia que presentamos demuestra que, para la población analizada, existe una concordancia del 100% en las muestras analizadas entre el genotipo RHD fetal mediante el kit de detección molecular utilizado y la determinación del antígeno D en sangre de cordón mediante las técnicas serológicas estándar (método de referencia).
En varios países del mundo, hace más de una década18–21, se utiliza esta herramienta de genotipificación fetal en sangre materna, incluso en el primer trimestre de gestación, para decidir la inmunoprofilaxis anti-D. Esta estrategia garantiza un mejor uso racional de la aloinmunización anti-D en beneficio de la madre y los futuros recién nacidos, disminuyendo el riesgo de enfermedad hemolítica fetoneonatal por el antígen D. En nuestro trabajo se determinó una sensibilidad y especificidad del kit diagnóstico de detección molecular del 100% cuando fue comparado con el método de referencia.
Cabe destacar que el test de detección molecular utilizado en el presente trabajo es un desarrollo nacional, a cargo de los autores de este trabajo. El mismo se desarrolló como una PCR in-house para uso interno en el laboratorio y se encuentra en proceso de desarrollo productivo, en base a los resultados obtenidos.
El proyecto se llevó adelante en embarazos únicos; sin embargo, consideramos que esta técnica diagnóstica es extrapolable a embarazos gemelares, como se aplica en los países ya citados, donde se utiliza esta estrategia. Del total de pacientes evaluadas, encontramos que un 65,5% (n=57) eran portadoras de un feto Rh D positivo y un 34,5% (n=30) eran portadoras de un feto Rh D negativo. Este resultado nos muestra que hay un 34,5 % de las pacientes en las que se realiza un uso inapropiado del recurso. Comparado con los registros de SIP en el Hospital de Clínicas de 2008 y 2018, en los que se evaluaron estas mismas variables, continuamos teniendo el mismo comportamiento poblacional de aproximadamente un 30 % de fetos RhD negativos. De este modo, se han generado erogaciones innecesarias desde la implementación obligatoria de la administración de IgG anti-D antenatal en 2011.
Consideramos que, con la evidencia actual y luego del registro ante los organismos pertinentes del Ministerio de Salud Pública, podría incorporarse a las recomendaciones y normativas vigentes desde 2011 para control de las gestantes RhD negativas la realización del genotipado fetal RHD a partir de la semana 17, evitando así la inmunoprofilaxis anti-D innecesaria en un grupo considerable de pacientes, siendo este un estudio actualmente costo-efectivo en relación a la utilización y disponibilidad en el mundo de hemoderivados20,22.
La implementación de la determinación del estatus para el gen RHD fetal en sangre materna, que reduciría la administración de inmunoprofilaxis anti-D, también pone en evidencia controles innecesarios, como la repetición de estudios inmunohematológicos (por ejemplo, la investigación de anticuerpos irregulares a lo largo del embarazo).
Otro aspecto relevante es el diagnóstico preciso del grupo sanguíneo fetal derivado del estudio de su genotipo, en un tiempo de la gestación que permite la toma de decisiones más apropiada para la gestante y sus futuros embarazos.
A modo de analizar el posible impacto en caso de implementar la genotipificación en las embarazadas en Uruguay, país que en el año 2021 registró 46.000 gestaciones, de las cuales el 15% de las gestantes fueron RhD negativas, se administraron 6.900 dosis de inmunoprofilaxis prenatal a las 28 semanas de gestación, sin conocer el estatus del genotipo fetal. Si a esto agregamos otras indicaciones, como genitorragias de la gestación, placentas previas o maniobras invasivas diagnósticas, el uso de profilaxis se incrementa en 1,5 veces (dato tomado del sistema informático del Banco de Sangre del Hospital de Clínicas). Por lo tanto, el número de dosis administradas no requeridas ascendería a 10.350. De estas, el 34 % corresponden a fetos RhD negativos, lo que da como resultado unas 3.500 dosis administradas de forma innecesaria.
Si analizamos el impacto económico, puede considerarse que, con un valor promedio actual en nuestro mercado de licitación público/privado de US$ 5.707,5 por dosis, un ahorro de 3.500 dosis representa aproximadamente US$ 529.804 Teniendo en cuenta que el test diagnóstico de genotipificación, una vez comercializado, tendría un costo aproximado de US$ 70/determinación, para los 6.900 casos de gestantes RhD negativo, se invertirán US$ 483.000, permitiendo un diagnóstico de mayor exactitud. A esto debe agregarse la implementación de una medicina dirigida, adaptada a las necesidades del paciente, y la optimización de un recurso finito como lo es un hemoderivado obtenido del plasma humano, actualmente escaso a nivel mundial.
Aunque se ha cuestionado la costoefectividad de la genotipificación fetal del gen RHD antes del nacimiento21,22, existe evidencia creciente que muestra sus beneficios tanto en términos de salud como a nivel económico23,24. Asimismo, se ha reportado que el ahorro más eficiente podría estar en el seguimiento de aloinmunizadas anti-D21, aspecto que, si bien no fue analizado en el presente trabajo, representa un componente a revisar en el futuro, y que podría evidenciar un ahorro adicional en gastos sanitarios, que se sumaría al aquí analizado.
A través de este ejemplo se evidencia que la herramienta utilizada para la genotipificación del RHD fetal, es costo-efectiva, permitiendo incluso una ligera disminución de los costos económicos, tomando en cuenta solamente la inmunoprofilaxis, sin analizar otros costos en salud como son la investigación de anticuerpos irregulares, el traslado de la paciente, el incumplimiento o el requerimiento eventual de otros estudios adicionales y de seguimiento, como pueden ser los imagenológicos (seguimiento ecográfico de anemia fetal mediante pico flujo de la arteria cerebral media).
Adicionalmente, el trabajo llevado adelante se basó en el desarrollo de un estudio colaborativo entre centros, contribuyendo a la mejora del conocimiento con una aplicación directa en el área clínica, y dando relevancia al enfoque académico desarrollado, mediante un trabajo interinstitucional e interdisciplinario que fortaleció a los equipos asistenciales involucrados, a los recursos humanos en formación y permitió obtener resultados más precisos en beneficio de nuestros pacientes.
Dado que, según la normativa actual, se administra una dosis de IgG anti-D de 120 microgramos por vía intravenosa en el período prenatal entre las 28 y 32 semanas de gestación y otra dosis postnatal en el caso de los recién nacidos RhD positivos, la adopción de esta estrategia permitiría un ahorro del 34% de la inmunoprofilaxis anti-D.
En este sentido, existen diversas experiencias, especialmente en países desarrollados como el Reino Unido y España, donde se ha implementado esta técnica, incluyéndola desde el primer trimestre de la gestación, con buenos resultados, evitando así la administración innecesaria de inmunoglobulina anti-D23.
Con base en la evidencia surgida en los últimos años, en las recomendaciones internacionales y en los resultados a partir del desarrollo de este trabajo, este equipo de investigación se encuentra en condiciones de recomendar que la genotipificación fetal RHD sea incorporada a la normativa de seguimiento de la embarazada, a los efectos de que las gestantes accedan a la herramienta disponible actualmente en nuestro país, con el costo-beneficio analizado. Avanzar en este camino, propendiendo prácticas que beneficien a los pacientes y sean costoefectivas, permitirá ampliar los beneficios en salud aquí analizados a otros países de la región latinoamericana.
